血清γ-球蛋白的分离-夏洪.pptVIP

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定 指导教师：夏 洪 李 晓 梅 本次实验内容 （一） 血清γ-球蛋白的分离与纯化 （二） 血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳 1．?掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3． 掌握离心机的正确使用方法。 【仪器试剂】 试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、双缩尿试剂、饱和硫酸铵溶液。 【实验原理 】 1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液2ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白α、β球蛋白）。 ⑴ 装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。 1．?使用离心机前注意配平； 2．?装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整； 3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间； 4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。 【思考题】 1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？ 2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？ 透析与浓缩（Dialysis technique） 透析： 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 浓缩（Anti-dialysis） 浓缩将凝胶过滤得到的γ－球蛋白液倒入透析袋内，悬于盛有浓蔗糖溶液的小烧杯内，振荡1小时以上，观察袋内液体体积变化 1. 掌握电泳的基本原理；2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和  应用。  【仪器试剂】 电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。 【实验原理 】 1. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全血清。 2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电流1mA/条，通电40-45min； 3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。 1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛 面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘 太近，不要重复点样； 4．膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极； 【思考题】 如果电泳结果证实γ球蛋白的分离效果不理想，应从哪些方面分析？ * * （一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化 实验17 【实验目的】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。 （1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素 ①电荷(同种电荷相斥） ②水化膜（隔离） Pr + + + + + + Pr + + + + + + 中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。 中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 沉淀蛋白质的方法还有哪些？ （2）盐析的影响因素 蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH值、温度等。 本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。 2.层析： 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 3.检测分离效果 （1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。 （2）双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。 【实验操作】 ⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好）。倾上清液（上清中主要含清蛋白α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。 2.脱盐： 注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整 （2）加样： 向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解