从动物血液提取SOD的工艺流程及技术.doc

从动物血液提取SOD的工艺流程及技术 ＳＯＤ(过氧化物岐化酶，Superoxide dismutase)存在于动物、植物及微生物中的金属酶，主要分为以下几种类型(如表)。 表　ＳＯＤ的分类及存在类　 ＳＯＤ用于延缓人体衰老，防止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等症，也被广泛地应用于生产日用化工品，如ＳＯＤ化妆护肤品，对抗衰老、去除脸面雀斑等有明显的效果。随着日用化工产品的发展及ＳＯＤ在临床上的应用，ＳＯＤ的需求量越来越大。 我国动物血源丰富，牛血、猪血的价格较低，生产ＳＯＤ工艺简单。所以，用牛血、猪血来提取ＳＯＤ具有较大的发展前途。现介绍用牛血、猪血来提取ＳＯＤ的方法。 1、工艺流程 2、技术操作要点 （1）分离： 新鲜动物血(牛血或猪血)收集后，用纱布滤出血液，以除去血液中的杂毛及其它异物，然后加入柠檬酸钠(一般10ｋｇ血液中加380ｍｇ柠檬酸钠)，充分搅拌均匀后以3000转/分的速度(以下如同)离心15～20分钟，收集血球，血浆可用于凝血酶的提取。 （2）去除血红蛋白： 用0.9%氯化钠溶液离心洗涤已收集的血球三次，每次氯化钠溶液用量为血球体积的2倍为宜。往已离心洗涤的血球中加入等体积的去离子水(或蒸馏水)，在温度2℃左右的条件下剧烈搅拌30～40分钟，并在同温下放置24小时左右。因为牛血ＳＯＤ对热较稳定，但猪血ＳＯＤ对热敏感，所以在分离或提取整个过程中温度控制在0～4℃，时间不要超过3天。若因其它原因，不能及时处理时，可以冷冻保存溶血溶液，并不影响其ＳＯＤ的活力。 （3）萃取： 往溶血溶液中分别缓慢加入溶血的血球0.25～0.3倍体积的95%冷乙醇和0.15～0.2倍体积的冷氯仿，充分搅拌30分钟，静置30分钟，然后进行离心分离，收集上清液。此时应注意有机溶剂的适当比例，才能有效地分离去除蛋白质等杂质，同时必须控制温度在2℃左右(不要超过5℃)，才能达到最佳分离效果。 （4）沉淀： 向上述上清液中加入1～2倍体积的冷丙酮，充分搅拌均匀，此时可产生大量白色沉淀，静置30分钟，然后进行离心分离，收集沉淀物。再用1.5倍的冷丙酮洗涤沉淀物，在温度2℃的条件下静置24小时左右。再进行离心分离，收集沉淀物。并把上层丙酮液合并在一起，回收丙酮，此丙酮可以重新使用。 （5）热变： 把ｐＨ值为7.6～7.8，浓度为2.5微摩尔/升的Ｋ2ＨＰＯ4——ＫＨ2ＰＯ4缓冲溶液加入到上述沉淀中，并在温度60℃下搅拌30分钟，然后迅速冷却到20℃，离心分离收集上清液。因为牛血ＳＯＤ在ｐＨ值5.3～9.5，猪血ＳＯＤ在ｐＨ值7.6～9.0范围内较稳定，所以必须掌握ＳＯＤ的最佳ｐＨ。 （6）洗涤： 向上清液中加入等体积的温度为2℃的丙酮，充分搅拌，并静置30分钟，再进行离心分离，收集沉淀物。此沉淀物中加入Ｋ2ＨＰＯ4——ＫＨ2ＰＯ4缓冲溶液，充分搅拌溶解，离心分离，收集上清液。 （7）精制： 柱长40ｃｍ，柱内径3ｃｍ的柱中装入已处理的二乙胺乙基葡萄聚糖凝胶离子交换剂(ＤＥＡＥ——ＳｅｐｈａｄｅｘＡ——50)，用ｐＨ值为7.7，浓度为2.5微摩尔/升的Ｋ2ＨＰＯ4——ＫＨ2ＰＯ4缓冲溶液上柱，当流出液的ｐＨ值为7.6时，将上述上清液上柱，用ｐＨ值为7.6的缓冲溶液进行梯度洗脱，收集具有ＳＯＤ的活性峰。因为ｐＨ值能控制ＳＯＤ分子的带电状态，盐浓度能控制结合键的强弱，所以上柱精制分离时应注意ｐＨ值和盐浓度。 （8）干燥： 将洗脱液装入透析袋内，并在去离子水中进行透析，将透析液进行超滤浓缩，冷冻干燥可得ＳＯＤ精制品。把ＳＯＤ精制品装入棕色瓶内，压紧瓶盖，放在通风、避光、干燥的地方保存。