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胰蛋白酶切修饰SOD的可行性研究
胰蛋白酶切修饰SOD的可行性研究
有机体细胞在正常代谢过程中,产生大量自由基,许多疾病的形成和发生与其有关。生物体内的SOD能通过歧化反应,消除O-2,从而避免了O-2对生物体的损坏,对生物起保护作用。SOD已广泛应用于医药、保健品、食品等领域。但SOD在实际应用方面存在着在体内半衰期短;分子量大,不易透过生物膜;异体蛋白免疫原性等问题。针对SOD半衰期短的特点,已有很多解决方法。但有关改变SOD分子量及去除免疫原性的解决方法,几乎未见报导。由于SOD的作用底物O-2很小,SOD酶活中心“口袋”也小,可以设想通过酶切除SOD的部分肽段后,仍保留其活力可达到降低分子量和抗原性的目的。有文献报导,SOD能被胰蛋白酶切除部分肽段,并得出SOD经胰酶水解后,仍能保持70%~85%酶活力的结论,但也有文献报导,在体外条件下,SOD不能被胰蛋白酶分解。为此,进行了如下实验:①用胰蛋白酶切割SOD;②取不同切割时间的SOD进行PAGE电泳;③对酶切处理前后的SOD活力进行测定。希望能为酶切修饰SOD可行性提供理论依据。
1、材料与方法
(1)材料
纯SOD:比活≥8000U/mgpro,河北省保定市生化营养源开发中心。胰蛋白酶:生化试剂,新疆化学研究所,上海化学试剂采购供应站经销。
(2)方法
胰蛋白酶水解SOD
将SOD溶于50mmol/LpH7 8的磷酸缓冲液后,加入胰蛋白酶,胰蛋白酶与SOD之质量比为2∶1,SOD2100U/mL,置于37℃恒温水浴中保温,分别于2,4,6,8,10h定时取样,以备电泳上样及酶活测定用。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离胶浓度10%,浓缩胶3 75%,0~4℃电泳6~8h。蛋白染色[2]:取一半胶板采用考马斯亮蓝特异快速染色法。活性染色[3]:取另一半胶板,先放入2 45×10-3mol/L的NBT溶液中,于黑暗条件下浸泡20min后放入3 6×10-2mol/LpH7 8的磷酸钠缓冲液(内含2 8×10-2mol/LTEMED和2 8×10-5mol/L核黄素)于黑暗中浸泡15min,最后将胶板取出再放入5×10-2mol/LpH7 8的磷酸钠缓冲液中,于4×8W日光灯下光照20~30min,直到蓝紫色背景出现清晰、透明的SOD活性染色条带为止。
SOD酶活力测定
采用邓碧玉法[4]。
2、结果与分析
(1)酶切对SOD活力的影响
SOD经胰蛋白酶水解后,活力呈明显下降趋势,酶解10h活力下降至原来酶活的80%左右(图1)。从对照SOD37℃保温不同时间酶活变化图中,亦呈现同样的下降趋势,且下降幅度与处理很相近,故推测胰酶水解SOD后活力下降在很大程度上归于37℃温度处理对胰蛋白造成的变性,影响了酶活力,而非胰蛋白酶水解造成酶活力的下降。
(2)酶切不同时间SOD PAGE电泳图谱变化
胰蛋白酶PI=10 8,该电泳条件下所带电荷与SOD相反,因而过量亦不会干扰电泳,即胰蛋白酶不会出现于电泳谱带中。
从图2看出胰蛋白酶水解处理后的SOD与对照SOD经PAGE电泳后,在蛋白染色图谱中都出现6条特征谱带,其Rf值分别为SOD 10 28,SOD 20 32,SOD 30 35,SOD 40 39,SOD 50 42,SOD 60 48。在图3活性染色图谱中,对照处理都出现4条带,它们迁移率与蛋白染色图谱中SOD 1,SOD 2,SOD 3,SOD 4完全一致,即SOD的6条蛋白带中,仅前4条有酶活力,SOD 5和SOD 6无活力,Cu·Zn SOD所表现的电泳多带现象在不同种属来源的SOD中普遍存在。如人Cu·Zn SOD呈7条带,猪血SOD只呈3条带,SOD分子聚合是造成PAGE多谱带现象的主要原因。无活性SOD在我国亦有报导,原因一方面可能酶活力过低无法检测出,另一方面有可能是SOD分子聚合造成的,难以定论,本实验在完全相同的进样量,电泳条件下,对照与处理SOD蛋白及活性染色谱带从迁移位置、谱带形状、颜色深浅上几乎完全一致,这与前人报导并不相同,即酶切后未获得多出对照的酶带,且共有酶带迁移率也未发现明显变化。笔者认为本实验所选取胰蛋白浓度及处理时间,足以保证酶对底物充分发挥水解催化作用。原因很可能是由于SOD的八股β 折叠围成的高度紧密的圆桶状结构,比较牢固,不易被胰蛋白酶水解,即使有水解、程度也很小,不会对整个多肽链造成大的切割伤害,没有产生大的游离多肽片段,因而水解后SOD PAGE电泳图谱无明显变化。
3、结论
通过胰蛋白酶水解SOD后的PAGE电泳图谱及对照、处理SOD不同时间酶活力的测定,认为SOD酶蛋白稳定,在体外条件下,胰蛋白酶不能水解SOD,胰蛋白酶处理后SOD活力的降低,可能是温度导致酶蛋白变性所致。
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