胰蛋白酶切修饰ＳＯＤ的可行性研究.doc

胰蛋白酶切修饰ＳＯＤ的可行性研究 有机体细胞在正常代谢过程中，产生大量自由基，许多疾病的形成和发生与其有关。生物体内的ＳＯＤ能通过歧化反应，消除Ｏ-2，从而避免了Ｏ-2对生物体的损坏，对生物起保护作用。ＳＯＤ已广泛应用于医药、保健品、食品等领域。但ＳＯＤ在实际应用方面存在着在体内半衰期短；分子量大，不易透过生物膜；异体蛋白免疫原性等问题。针对ＳＯＤ半衰期短的特点，已有很多解决方法。但有关改变ＳＯＤ分子量及去除免疫原性的解决方法，几乎未见报导。由于ＳＯＤ的作用底物Ｏ-2很小，ＳＯＤ酶活中心“口袋”也小，可以设想通过酶切除ＳＯＤ的部分肽段后，仍保留其活力可达到降低分子量和抗原性的目的。有文献报导，ＳＯＤ能被胰蛋白酶切除部分肽段，并得出ＳＯＤ经胰酶水解后，仍能保持70%～85%酶活力的结论，但也有文献报导，在体外条件下，ＳＯＤ不能被胰蛋白酶分解。为此，进行了如下实验：①用胰蛋白酶切割ＳＯＤ；②取不同切割时间的ＳＯＤ进行ＰＡＧＥ电泳；③对酶切处理前后的ＳＯＤ活力进行测定。希望能为酶切修饰ＳＯＤ可行性提供理论依据。 1、材料与方法 （1）材料 纯ＳＯＤ：比活≥8000Ｕ/ｍｇｐｒｏ，河北省保定市生化营养源开发中心。胰蛋白酶：生化试剂，新疆化学研究所，上海化学试剂采购供应站经销。 （2）方法 胰蛋白酶水解ＳＯＤ 将ＳＯＤ溶于50ｍｍｏｌ/ＬｐＨ7 8的磷酸缓冲液后，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与ＳＯＤ之质量比为2∶1，ＳＯＤ2100Ｕ/ｍＬ，置于37℃恒温水浴中保温，分别于2，4，6，8，10ｈ定时取样，以备电泳上样及酶活测定用。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离胶浓度10%，浓缩胶3 75%，0～4℃电泳6～8ｈ。蛋白染色[2]：取一半胶板采用考马斯亮蓝特异快速染色法。活性染色[3]：取另一半胶板，先放入2 45×10-3ｍｏｌ/Ｌ的ＮＢＴ溶液中，于黑暗条件下浸泡20ｍｉｎ后放入3 6×10-2ｍｏｌ/ＬｐＨ7 8的磷酸钠缓冲液(内含2 8×10-2ｍｏｌ/ＬＴＥＭＥＤ和2 8×10-5ｍｏｌ/Ｌ核黄素)于黑暗中浸泡15ｍｉｎ，最后将胶板取出再放入5×10-2ｍｏｌ/ＬｐＨ7 8的磷酸钠缓冲液中，于4×8Ｗ日光灯下光照20～30ｍｉｎ，直到蓝紫色背景出现清晰、透明的ＳＯＤ活性染色条带为止。 ＳＯＤ酶活力测定　 采用邓碧玉法[4]。 2、结果与分析 （1）酶切对ＳＯＤ活力的影响 ＳＯＤ经胰蛋白酶水解后，活力呈明显下降趋势，酶解10ｈ活力下降至原来酶活的80%左右(图1)。从对照ＳＯＤ37℃保温不同时间酶活变化图中，亦呈现同样的下降趋势，且下降幅度与处理很相近，故推测胰酶水解ＳＯＤ后活力下降在很大程度上归于37℃温度处理对胰蛋白造成的变性，影响了酶活力，而非胰蛋白酶水解造成酶活力的下降。 （2）酶切不同时间ＳＯＤ ＰＡＧＥ电泳图谱变化 胰蛋白酶ＰＩ=10 8，该电泳条件下所带电荷与ＳＯＤ相反，因而过量亦不会干扰电泳，即胰蛋白酶不会出现于电泳谱带中。 从图2看出胰蛋白酶水解处理后的ＳＯＤ与对照ＳＯＤ经ＰＡＧＥ电泳后，在蛋白染色图谱中都出现6条特征谱带，其Ｒｆ值分别为ＳＯＤ 10 28，ＳＯＤ 20 32，ＳＯＤ 30 35，ＳＯＤ 40 39，ＳＯＤ 50 42，ＳＯＤ 60 48。在图3活性染色图谱中，对照处理都出现4条带，它们迁移率与蛋白染色图谱中ＳＯＤ 1，ＳＯＤ 2，ＳＯＤ 3，ＳＯＤ 4完全一致，即ＳＯＤ的6条蛋白带中，仅前4条有酶活力，ＳＯＤ 5和ＳＯＤ 6无活力，Ｃｕ·Ｚｎ ＳＯＤ所表现的电泳多带现象在不同种属来源的ＳＯＤ中普遍存在。如人Ｃｕ·Ｚｎ ＳＯＤ呈7条带，猪血ＳＯＤ只呈3条带，ＳＯＤ分子聚合是造成ＰＡＧＥ多谱带现象的主要原因。无活性ＳＯＤ在我国亦有报导，原因一方面可能酶活力过低无法检测出，另一方面有可能是ＳＯＤ分子聚合造成的，难以定论，本实验在完全相同的进样量，电泳条件下，对照与处理ＳＯＤ蛋白及活性染色谱带从迁移位置、谱带形状、颜色深浅上几乎完全一致，这与前人报导并不相同，即酶切后未获得多出对照的酶带，且共有酶带迁移率也未发现明显变化。笔者认为本实验所选取胰蛋白浓度及处理时间，足以保证酶对底物充分发挥水解催化作用。原因很可能是由于ＳＯＤ的八股β 折叠围成的高度紧密的圆桶状结构，比较牢固，不易被胰蛋白酶水解，即使有水解、程度也很小，不会对整个多肽链造成大的切割伤害，没有产生大的游离多肽片段，因而水解后ＳＯＤ ＰＡＧＥ电泳图谱无明显变化。 3、结论 通过胰蛋白酶水解ＳＯＤ后的ＰＡＧＥ电泳图谱及对照、处理ＳＯＤ不同时间酶活力的测定，认为ＳＯＤ酶蛋白稳定，在体外条件下，胰蛋白酶不能水解ＳＯＤ，胰蛋白酶处理后ＳＯＤ活力的降低，可能是温度导致酶蛋白变性所致。