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免疫组化基本技术(三)免疫组化基本技术(三)
6.根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件(1)大动物组织(狗、兔、小儿尸检)脱水、透明和浸蜡时间 75%乙醇30~120min,85%乙醇30~120min,95%乙醇Ⅰ 2h,95%乙醇Ⅱ 2h,95%乙醇Ⅲ过夜,无水乙醇Ⅰ30~60min,无水乙醇Ⅱ30~60min,无水乙醇Ⅲ60min~120min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定),石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ1~2h,石蜡Ⅲ2~3h。 (2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75%乙醇30min,85%乙醇30min,95%乙醇Ⅰ1h,Ⅱ1h,Ⅲ过夜或2h,无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min,二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min,Ⅲ10min(肉眼观察),石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ30min,石蜡Ⅲ1~2h。 (3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75%乙醇30min,85%乙醇1h,95%乙醇Ⅰ1h,Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜,无水乙醇Ⅰ30min,Ⅱ1~2h和Ⅲ4h,二甲苯Ⅰ30min,Ⅱ30min和Ⅲ1h。 七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片,IHC切片要求不同与常规切片,需连续有序,防止脱片等特殊要求。 1.切片前的准备工作(1)载玻片的清洁:市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,凉干涂胶,如需开展原位杂交,还需将玻片240℃烤2h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸(分子量300KD):0.5%浓度。 APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷):干净载玻片→丙酮5min →APES(1ml+50ml丙酮):用镊子夹住浸入APES试剂1~3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好,室温或4℃保存备用。 铬矾明胶液: 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml甲醛明胶液: 40%甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml 2.石蜡切片:3.冰冻切片:IHC冰冻切片,ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机) 4.切片要求及注意事项: (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52-60℃烤片18h。 (3)切片厚2~4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年(石蜡切片) (7)冰冻切片需凉干后立即固定(8)冰冻切片分固定和新鲜组织,固定组 织需经庶糖处理24h,冰冻切片。(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用 八、组织与细胞材料的保存 1.冷冻保存: -80℃,-145℃,-198℃ 组织应在离体30min内,快速取材,放入专用冷冻管中,并编上号,登记在册。 2.新鲜组织经适当固定后,装入冻存管 中,-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上,9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用,大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。 第二部分 IHC的一些基本技术 主要内容 一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、IHC的非特异性染色 五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、IHC常用缓冲液 一、实验的设计 1.查阅相关文献,列出要做的IHC指标,根据经费情况,选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。 2.列出IHC实验操作流程,选择何种IHC前 处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度, 应设置何种对照。 4.每批实验应用同一稀释度的一抗,孵育 时间和温度,同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准6.预期达到的目标 二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从-80℃取出,凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。 二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min,二甲苯Ⅲ10min,无水乙醇2min,95%乙醇2min,85%乙醇2min,75%乙醇2min,流水冲洗。 三、内源性酶的消除方法(一)内源性过氧化物酶的消除方法: 1. 0.3%~3%H2O2甲醇液20min 2. 1% H2O2 20min 3. 3%苯肼溶液 37℃ 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30min * 免疫组化基本技术(三) *
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