如何用好HPLC.ppt

如何用好HPLC …得到好结果的技巧! HPLC如何得到好的结果 … 流动相 缓冲液 / 溶剂选择, 梯度优化, 流速选择 脱气，流速稳定, 流动相制备 柱 高柱效, 二级作用力, 柱间变异, 温度控制 检测 灵敏度, 选择性, 温度波动影响 样品 提取方法选择, 样品溶剂选择, 氧气影响 仪器 性能, 稳定性, 耐用性, 易操作性 综合评估 分析技术的稳定性,可靠性, 定量准确性 ? 流动相? 溶剂混和率及其制备 (1) 下面的两种配制一样吗? 水 / 乙醇= 1/1 (v/v) 50%(v/v) 乙醇水溶液 ? 流动相? 溶剂混和率及其制备 (2) 水/乙醇=1/1 (v/v) 分别量取500ml水和乙醇, 然后混和 混和体积不是 1L. 50%(v/v) 乙醇水溶液. 加500ml乙醇于1L的容量瓶中, 加水至刻度. 水的比例更高. ? 流动相? 溶剂混和率及其制备 (3) 配制: 20mM 磷酸缓冲液 (pH2.5)  不一样的解释… Dihyrocodeine 出峰位置不一样 流动相缓冲能力弱… pKa 与流动相pH相近的酸和碱的峰形变差. 保留时间改变 峰面积改变 ? 定量错误!! 对绝对量响应的检测器  ? 流速不影响峰面积. 对浓度响应的检测器  ? 流速影响峰面积. *几乎所有的 LC 检测器均为浓度型检测器 两台泵进行混和时… 荧光检测器 氧气引起荧光猝灭 → 改变峰面积 吸光型检测器 改变背景吸收 → 基线波动 (特别是在梯度洗脱时) 氧气吸收峰出现 示差折光检测器 基线波动 流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度. 脱气时间对气－液半透膜 脱气效果的影响. 如果溶解的氧气浓度高， 有机溶剂的吸光度液也高. 在短波长区影响更为明显. 进流动相引起出峰!? 一般, 环境温度影响光谱图的形状. 不控制温度时峰面积比较 (34?C) 不冷却时, 抗坏血酸逐渐降解. 不同样品溶剂对理论塔板数的 影响. 如果样品溶剂比流动相强 , 峰形恶化. 提高分析的准确度 离线前处理很难保证完全一致, 可能降低准确度 简化操作 离线处理需要很强的技能 提高处理效率 晚上也能进行自动前处理, 可以极大的提高处理效率 原因: 由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属离子的吸附(离子或者碱性化合物) 清除吸附的化合物 （洗针） 控制吸附产生 （使针惰性化） 原因: 由于树脂氢键力引起的吸附 (脂溶性化合物) 使用有机溶剂清洗转子密封槽 改变转子密封材料来降低吸附 若控制由于离子作用力或 配位异构力引起的对 金属离子的吸附(离子或者碱性化合物) … 酸化. 大浓度的配位离子作离子对试剂. (例如) 100mM 高氯酸水溶液 / 甲醇(或乙腈) 由于疏水作用力引起的化合物吸附 ( 树脂型化合物) 有机溶剂清洗. * (例如) 100% 甲醇, 乙腈, THF等. 被分析物 : 氯乙醇 (碱基化合物) 进 2?L 的标准溶液 (含有 1.2mg/ml 溶解化合物的流动相), 连续注射 2?L 的流动相, 比较面积. 不同惰性化SUS针密封方法的比较 疏水性化合物吸附被认为主要在通过样品的转子密封槽. 由于流动相一直在洗这些吸附物, 污染会逐渐流出. 被分析物 : Vitamin A Acetate 进 10μL 的标准溶液 （10μg/mL: 甲醇溶解）, 然后进 10μL 的空白溶液 (甲醇), 并比较峰面积. 使用 PEEK材质的转子密封, 甚至老化 20 分钟后, 几乎观察不到交叉污染. 感恩的心，感谢有你！谢谢你的欣赏！ 全力打造精品课件，教学资料，感谢你的欣赏 血浆中分别添加 2mg/mL ketoprofen 和naproxen 的回收率比较(50mL进样.) 手动预处理 (添加乙腈) 用Co-Sense进行自动预处理 ? 样品? 不同预处理方法的回收率比较 ? 样品?过载的原因及控制 使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段 清洗此表面是重要的 针 清洗状态 进样状态 样品环 泵 柱 洗针口 针 针密封 ? 样品? 洗针机理 (全量进样) ? 样品? 洗针溶剂的选择 柱　 ：Shim-pack VP-ODS (150mmL.x 2.0mm I.D.) 流动相 ：含有100mMNaClO4的 10mM 磷酸缓冲液 (pH 2.6) / 乙腈 　　　　　　 = 55 / 45 (v/v) 流速　　 ：0.2mL/min 温度　：40oC 检测　　 ：UV (260nm，using semi micro cell) ? 样品? 降低由于碱性物质引起的交叉污染 (1) 0.0425 0.000425 1 W/O Wash 0.07