N_氨甲酰水解酶的纯化及性质.docx

N2氨甲酰水解酶的纯化及性质李苏平,李家璜,严明,姚忠,朱姝(南京工业大学制药与生命科学学院,南京210009)摘要从Burkholderiacepecianjut1分离纯化N2氨甲酰2D2氨基酸水解酶(NDase)。实验表明,该酶亚基35KD,最适温度为52℃,最适pH为7.2左右。以N2氨甲酰2D2苯丙氨酸作底物,其米氏常数Km为10.22mmol/L,最大反应速度Vmax为0.27mmol/(L·min)。实验表明二价金属离子对酶活有重要影响。关键词:N2氨甲酰2D2氨基酸水解酶;纯化;性质D2氨基酸是合成抗生素、多肽类激素、多种农药的原料和中间体,在药学领域有广泛的应用。例如D2苯甘氨酸和D2对羟苯甘氨酸就是制备羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄等β2内酰胺半合成抗生素的重要原料;D2苯丙氨酸可作为制备凝血酶抑制剂的原料。利用海因酶法可以不对称水解5’2取代海因衍生物生成D2氨基酸1,具有极大的工业价值。目前,利用海因酶法不对称合成D2氨基酸已经成为研究的热点,具有广泛的应用前景1。N2氨甲酰基2D2氨基酸酰胺水解酶(N2car2bamoyl2D2aminoacidamidohydrolase,简称NDase)(EC)是海因酶法生产D2氨基酸中关键的酶。生物转化生产D2型氨基酸,是医药和食品行业获得D2氨基酸的主要途径2。它的催化反应为:酶的性质。Burkholderiacepecianjut1是本实验室保藏的含有海因酶和N2氨甲酰氨基酸酰胺水解酶的菌株,本文报道N2氨甲酰氨基酸酰胺水解酶纯化和酶学性质的研究,为进一步利用和基因改造N2氨甲酰氨基酸酰胺水解酶提供重要依据。材料与方法11.1试剂与设备Burkholderiacepecianjut1为本实验室保藏。N2氨甲酰2D2苯丙氨酸实验室自制,葡聚糖凝胶G2200和疏水层析HiPrepTM16/10以及强阴离子交换柱SOURCETM15QPE4.6/100均为Pharmacia产品,其他试剂为国产分析纯。毛细管电泳为BECK2MAN产品。酶的纯化在AKTAexplore100层析系统(Pharmacia)中进行。1.2发酵产酶条件1L培养基组成为:葡萄糖20g,玉米桨25mL,10%NaCl30mL,10%KH2PO420mL,10%Mg2SO42.5mL,1%CoCl25mL,蛋白胨0.5%,诱导剂Ⅰ1.5g,诱导剂Ⅱ0.2g.加入1L水,调节pH7.5,加消泡剂7～8滴,在121℃灭菌20min然后接种。1.3酶活力的测定1mL酶液中加入2mL0.12%N2氨甲酰2D2苯丙氨酸(N2Phe)52℃下,pH7.2,反应20min,沸水浴10min终止反应,离心,毛细管电泳测D2苯丙氨图1N2氨甲酰基2氨基酸酰胺水解酶水解过程目前有关NDase的纯化和性质的研究的报道还不多见:Louwrier等人对Agrobacteriumsp.中的NDase进行了提纯并对其性质进行研究3,Sa2reen4等人用亲和层析对酶进行了纯化;Ragnitz5等人对酶进行纯化和固定化。在国内仅有袁静明等人从Pseudomonassp.中纯化了NDase2,并考察了作者简介:李苏平(1976～),女,2001级硕士研究生。电话:025-3587330或3587341,E-mail:lisp2004@—37—工业微生物第1期第35卷酸的量。酶活力单位的定义:上述条件下每分钟生成1μmolD2苯丙氨酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。比活力为1mg蛋白的酶活力(U/mg)。1.4蛋白质浓度结果22.1NDase纯化NDase纯化情况见表1。最终酶纯化15.7倍,收率仅0.75%。这可能因为Burkholderiacepecianjut1中的NDase的含量不高,并且在纯化过程中NDase的失活,造成较低的收率。表1NDase的纯化总表采用Bradford方法,以牛血清蛋白为标准61.5NDase的纯度鉴定。以SDS2PAGE电泳按文献进行71.6NDasw纯化1.6.1粗酶提取200g菌泥溶解在含2mmol/L1,42二硫代苏糖醇(DTT)的20mmol/LpH7.2磷酸缓冲液600mL中用超声波法进行细胞破碎20min,然后离心得粗酶提取液。1.6.2(NH4)2SO4沉淀将(NH4)2SO4固体加入粗酶提取液达到45%饱和度,静置4h,10000r/min离心15min,NDase活性主要集于沉淀,沉淀溶于0.5mol/L(NH4)2SO4磷酸缓冲液(20mmol·L-1)pH7.2,并且加入10mmol/L的DTT。1.6.3疏水层析0.5mol/L(NH4)2SO4,2mmol/LDTT,0.1mol/LNaCl20mmol/LpH7.2磷酸缓冲液以5个床体积平衡Phenyl2Sepharose预