四肝组织中核酸的提取和鉴定.docVIP

实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定 【】 【】 RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。三氯醋酸沉淀核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA为核糖，DNA为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用生成磷钼酸，磷钼酸硫酸亚铁还原成蓝色的钼蓝。嘌呤碱嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物。 戊糖核糖经浓酸作用则生成醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物。 ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 【】 【 1.生理盐水。 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。 95% 乙醇。 NaCl溶液NaCl 10g溶于蒸馏水至100ml。 0.92 mol/L H2SO4 取浓H2SO4（比重1.84，含量98%）5ml加入蒸馏水中至100ml 。 钼酸铵试剂钼酸铵3g，溶于70ml蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO4 14ml ，冷却后再加至100ml，混匀备用。 硫酸亚铁试剂硫酸亚铁10.6g，硫脲5g，蒸馏水溶解至500ml，冰箱内保存备用。 浓氨水。 0.29mol/L AgNO3 取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml，于棕色瓶避光保存。 3,5二羟甲苯试剂取100ml，加入FeCl36H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后，置于棕色瓶中临用配制。（市售3,5二羟甲苯不能直接使用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色后方可使用）。 二苯胺试剂取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中，加入2.75ml浓硫酸，盛于棕色瓶中，临用配制。 【】 核酸的提取与分离：1）新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中，加入等量的生理盐水，制成匀浆。 2）5ml肝匀浆置于离心管内，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml，用玻棒搅匀，静置8分钟后离心。 乙醇5ml，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口，在水浴中2分钟冷却后离心。 NaCl溶液4ml，置于沸水浴中加热8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出冷却后再离心。 （6）取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内，即可见白色沉淀逐渐。静置10分钟后，将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心，弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。 核酸的水解在含有核酸钠的离心管内加入0.92mol/L的H2SO4 4ml15分钟。 核酸组成成分的鉴定 按下表操作0.92mol/L H2SO4溶液 － 5滴 钼酸铵试剂 3滴 3滴 硫酸亚铁试剂 10滴 10滴 （2）嘌呤碱的鉴定：按下表操作0.92mol/L H2SO4溶液 － 10滴 浓氨水 数滴（使呈碱性） 数滴（使呈碱性） 0.29mol/L AgNO3 5滴 5滴 观察加入AgNO3后有何变化。静置15分钟后，再比较两沉淀. 3）核糖的鉴定：按下表操作0.92mol/L H2SO4溶液 － 4滴 3，5-二羟甲基试剂 6滴 6滴 混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管颜色有何不同。 （4）脱氧核糖的鉴定：按下表操作 核酸水解液 10滴 － 0.92mol/L H2SO4溶液 － 10滴 二苯胺试剂 15滴 15滴 混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管有何不同。 【】 【】 RNA与DNA的组成成分有何？