86例乳腺增生者brca2和chek2基因拷贝数分析.docVIP

精品论文 参考文献 86例乳腺增生者BRCA2和CHEK2基因拷贝数分析 王秋华1 聂昌君1 罗世强1 朱柳静2 唐宁1 1.柳州市妇幼保健院医学遗传科，柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室 2.柳州市妇幼保健院乳腺专科 广西 柳州 545001 基金项目：Z2013600 [摘 要] 目的：探讨乳腺癌易感基因在乳腺增生个体中的拷贝数变异。方法：应用多重连接依赖式探针扩增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术检测86例乳腺增生患者BRCA2和CHEK2基因拷贝数变异。结果：在86例乳腺增生患者中，发现1例CHEK2基因可疑缺失，而BRCA2基因未发现拷贝数变异。结论： BRCA2和CHEK2基因拷贝数变异不是乳腺良性增生的重要原因。。 [关键词] 乳腺增生；多重连接依赖式探针扩增（MLPA）；BRCA2；CHEK2 乳腺增生症的发病率占育龄妇女的80%~ 90%，占全部乳腺疾病的75%，是育龄妇女最常见的乳腺病，其患病率近年来呈现逐年上升的趋势[1]。大量研究表明乳腺良性疾病是乳腺癌发生的重要原因之一。乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁女性健康[2]。 本研究选择86例乳腺增生症患者作为研究对象，采用多重连接探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification）对BRCA2和CHEK2基因拷贝数测定，旨在进一步探讨乳腺癌易感基因拷贝数变异在乳腺良性增生疾病发生中的作用，为乳腺癌的预防及早期诊断提供依据。 1 对象与方法 1.1 研究对象 受检对象来自于2014年5月至2015年8月柳州市妇幼保健院乳腺科因乳腺增生在医院就诊的患者。所有患者均经超声和钼靶检测确诊。本研究受检对象均已签署知情同意书。 1.2 基因组DNA提取及浓度分析 抽取患者静脉血2~4 mL，EDTA抗凝，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，使用紫外分光光度计测定所提取DNA在260 nm和280 nm处的吸光值，得出其浓度及纯度，并用TE溶液稀释至50 ng/mu;L的终浓度。纯度要求A260/A280在1.7-2.0之间。 1.3 多重连接依赖的探针扩增（MLPA）分析 本研究采用荷兰MRC公司研发的SALSA MLPA P045 CHD试剂盒，共44条探针，33条探针位于BRCA2基因（外显子1~23）及其上下游区域，3条探针位于分别位于CHEK2基因外显子10、1100delC突变位点及其下游区域。5q31、4q35、12q23、2q13、12q13、11q22、11q12和2q32各一条探针作为对照。 1.3.1 多重探针杂交 取待测样本DNA150 ng置于PCR管中，加TE至总体积为5 mu;L，于9700基因扩增仪（9700型，美国ABI公司）上98℃变性5 min，快速降温，25℃保持。取出PCR管后加入多重探针及MLPA缓冲液各1.5 mu;L，充分混匀后，95℃变性1 min，60℃杂交16～20 h，54℃维持。 1.3.2 多重探针连接反应 在上述PCR管内加入连接酶-311 1 mu;L和连接酶缓冲液A、B各3 mu;L，及H2O 25 mu;L配成的连接混合液32 mu;L，54℃ 反应15 min，然后98℃ 5 min灭活连接酶-311，20℃维持。 1.3.3 多重PCR反应 在上述连接产物中，加入PCR引物及相应缓冲液混合液2 mu;L、聚合酶0.5 mu;L 、H2O 7.5mu;L配制成的混合液10 mu;L，总反应体系50 mu;L，进行PCR扩增。扩增条件为95℃变性 30 s、60℃退火 30 s、72℃延伸60 s，35个循环，72℃延伸20 min，15℃维持。每一批反应均有两个正常样本作为对照（Human Genomic DNA，美国Promega公司）。 1.3.4 MLPA产物分析和结果判读 利用遗传分析仪（3500Dx型，美国ABI公司）对多重PCR扩增产物进行毛细管电泳和数据采集，用GeneMapper 3.7软件（美国ABI公司）获得各探针位点峰高和峰面积。所采集的数据通过Coffalyser.Net专用软件（荷兰MRC公司）进行分析，得出基因相对拷贝数比值（Ratio值）。根据试剂盒说明书，以Ratio值在0.7~1.3之间判定为正常，Ratio值lt;0.7为存在基因缺失，Ratio值gt;1.3为存在基因重复。 2 结果 2.1 86例乳腺增生患者MLPA分析