人内皮抑素基因改造、表达、纯化和活性检测研究.pdfVIP

哈尔滨医科大学硕士论文 中 文 摘 要 目的:对已定点诱变的人内皮抑素 E〔ndostatin)基因进行改造并克隆，以减 小其分子量，提高临床应用安全性。初步检测其表达蛋白的生物学活性。方法: 用限制性内切酶酶切重组质粒PETIIa/诱变Endostatin，得到了含诱变部分的288 个碱基，并将其与表达质粒pTYB-2重组，转化入受体菌BL-2I(DE3)中，用 IPTG诱导以包涵体形式表达，破包涵体，蛋白质经变性，复性后几丁质亲和层 析进行一步纯化，鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管检测活性。结果:改造后内皮 抑素基因经限制性内切酶酶切和测序鉴定，其大小和核昔酸序列正确。获得了改 造后的内皮抑素蛋白，CAM实验，对照组血管明显减少。结论:成功改造了内 皮抑素基因，构建了原核表达载体，并得到了具有生物活性的改造后的内皮抑素 蛋白，为进一步的肿瘤临床治疗奠定了基础。 关键词:人内皮抑素 基因改造 DNA重组 亲和层析 哈尔滨医科大学硕士论文 ABSTRACT Purpose:Tofurtherreformthesite-directedmutatedhumanEndostatingeneand cloneitinordertoloweritsmolecularwightandenhanceitssafetyinclinical applicationandtodetectthebiologicalactivitiesofthenewprotein.Methods: ModifiedhumanEndostatingenerfagment,includingthemutagenesisrfagment,was acquiredbyrestrictionendonucleasecutting.ThentheDNAfragmentwasclonedinto theEcoliexpressionplasmidpTYB-2andtransformedintoE.colistrainBL21(DE3). TransformantswereinducedbyIPTG,andthenexpressed.Afterpurificationbyonly one-stepaffinitychromatography,themodifiedhumanEndostatinproteinwas obtainedanditsactivitywasanalyzedbymeansofchickembryoallantoidmembrane (CAM).Results:Themodifiedendostatingenewasconfirmedbyrestriction endonucleasedigestionandtheresultofsequencingwasconsistentwithsequence wedesigned.Themodifiedendostatinproteinwasacquiredandprovedthatthevessel decreasedafterthenewproteinhadbeeninjectedintoCAM.Conclusion:The modifiedhumanEndostatinproteincaninhibitproliferationofvascularendothelial cellbybiologicalactivitydetermination. Keywords:humanEndostatin,genemodification,DNA cloning,affinity chromatography 哈尔滨医科大学硕士论文 综 述 1.肿瘤与血管 在机体内无论何处，只要有器官形成发生就有新血管的形成，这对于氧、营 养、代谢产物的输送是必需的。器官和组织血管系统的形成有两个过程，即血管 发生和血管新生。血管发生指的是来源于中胚层的内皮细胞前体的原位分化及其 与形成初期血管的联系，常见于胚胎发生的初期和来源于中胚层和内胚层器官的 器官血管形成期，如肺，小肠等。而血管新生指的是源于形成血管的内皮细胞通 过出芽的方式形成新的毛细血管的过程，它并非局限于