人尿嘧啶糖基化酶cDNA编码序列的克隆及其在食管鳞癌组织中的检测研究.pdfVIP

人尿嗜陡糖基化酶cDNA编码序列的克隆及其在食管鳞癌组织中的检测 摘要 碱基切除修复是修复各种来源的DNA损伤的主要途径，该途径由DNA糖基化 酶起始。DNA糖基化酶可以特异的切割连接碱基与脱氧核糖的糖营键。尿啼咤糖 基化酶(UNG)起始从DNA上切除尿喃咤的一个系列反应，其表达具有时空特异性， 并主要在转录水平上受调控。通常癌症发生时，细胞的无限增殖也会伴随着UNG 表达水平上调。这使得以UNG表达水平作为癌症诊断辅助指标成为可能。 为了探索UNG与癌症之间的联系，从人绒癌细胞株JEG-3中克隆得到了UNG 的cDNA编码序列。克隆片段两端通过PCR方式引入EcoRI和SalI位点以便后 续操作。该片段及载体pET-21(a)在EcoRI和SalI双酶切后连接得到重组质粒 pUNG。测序检验后，以pUNG转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达外源蛋 白。用超声波破碎诱导后的菌体并进行SDS分析，可以看到39kD左右的蛋 白条带。重组质粒的分子量计算确定后，经适当比例稀释，即为检测中所用定量 标准。 提取18对食管鳞癌组织标本中的总RNA，并用定量RT-PCR的方法检测了样 本中UNGmRNA的拷贝数。18例食管鳞癌标本中有13例阳性结果;而18例对照 中无阳性结果检出。统计表明UNG高表达与食管鳞癌之间确有联系存在。 关键词 尿啼淀糖基化酶 定量PCR表达 食管鳞癌 人尿嗜陡糖基化酶cDNA编码序列的克隆及其在食管鳞癌组织中的检测 4 CloningofHumanUraci N-glycosylaseandtheEnzyme Expression inCancerTissuesviaOuantitativeRT-PCR BaoIlong-Bo(BiochemistryandMolecularBiology) DirectedbyProf.QianShi-Jun Abstract UracilmaybepresentinDNAduetomisincorporationofdUTPinplace ofdTTPorbydeaminationofcytosine.ThelattercanresultinaGCto ATtransitionmutationiftheuracilisnotremovedbeforeDNAreplication Baseexcisionrepair(BER)isamajorpathwayforremovalofDNAlesions arisingfromendogenousprocessesaswellasthoseinducedbyexposure to exogenous chemicals and irradiation. BER is initiatedbyDNA glycosylasesthatexciseaberrantbasesfromDNAbycleavageofthe N-glycosidicbondlinkingthebasetoitsdeoxyribosesugar.Uracil N-glycosylase(UNG) istheenzymeresponsibleforthefirststepinthe BERpathwaythatspecificallyremovesuracilfromDNA.The gene undergoesbothto叩oralandspatialregulationmainlyatthelevelof Normallycancercellsundergoover-proliferationandUNG transcription. hasbeenup-regulatedduringthetumorigenesis.Theremightbea possibilityoftheexpressionlevelofcellularUNGasanassistantfor cancerpredictionanddiagnosis ToexplorethecorrelationbetweenUNGlevelandcancerprogress,the