人工皮肤种子细胞体外分离、培养及鉴定的实验研讨.pdfVIP

人工皮肤种子细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究 中文摘要 目的:探索实验条件下人角质形成细胞及成纤维细胞的体外培养技术，明确培养的角 质形成细胞中是否存在表皮干细胞，确定表皮干细胞在皮肤组织中的定位。方法:利用细 胞工程方法进行组织分离、原代培养及传代培养等，观察细胞形态;(1)通过免疫组化方 法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特 异标识分子一CK19对其进行检测分析;(2)利用波形丝蛋白抗体对培养的成纤维细胞进行 鉴定;(3)通过免疫组化方法，利用CK19作为特异标识分子，观察人表皮干细胞在不同 解剖结构皮肤组织的定位。结果:1、表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细 胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示;CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮 十细胞存在。2、利用组织块培养方法，通过倒置显微镜观察及免疫组化染色进行细胞鉴定 并证实得到较纯的成纤维细胞。3、免疫组化染色发现CK19阳性细胞位于无毛区皮肤组织 的基底层，位于有毛区皮肤组织的毛囊外毛根鞘。结论:体外分离、培养角质形成细胞及 成纤维细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在:表皮干细胞在无毛区 皮肤组织中位于表皮基底层，在有毛区皮肤组织中位于毛囊外毛根鞘。为人工皮肤的成功 构建奠定了基础。 关键词;角质形成细胞 表皮干细胞 成纤维细胞 细胞培养 角蛋白19 *:及南省-a大攻关项目 异《种人工皮肤制备及临床应用》子课题 TheIsolation,CultureandIdentificationof keratinocyteandFibroblast Abstract O坷ective;Toexplosethecultivatingtechniqueofhumankeratinocyteandfibroblastunder laboratoryconditions,andtostudytheexistenceofepidermalstemcellinculturedhuman keratinocyteinvitro,andtoexplosethelocalizationofCK19-positive-cellsinvariousanatomic siteofhumanskin.Methods:cellengineeringthchniquesincludingisolation,cultureand subcultureofhumankeratinocytesandfibroblastswereused,andtoobservethepatternand growingcourseofcells.(1)Bymeansofantibodyofcytokeratin,thekeratinocyteswere identificatedbyimmunohistochemistry.Theculturedcellswereanalysedwiththemonoclone antibodyofcytokeratin19.(2)Bymeansofantibodyofviment,thefibroblastswereidentificated byimmunohistochemistry.(3)Bymeansofthemonocloneantibodyofcytokeratin19,toobserve thelocalizationofCK19-positive-cellsinvariousanatomicsitesofhumanskin.Result:1、The epidermiswereseparatedrfomthedermisintactly.Theculturedcellswereconfirmedbymeans ofelectronmicroscopyandSPimmunohistochemicalmethods.TheexpressionofCK19 indicatedthattherewereepidermalstemcellinculturedcells.2,Organizationculturemethods wereused，toacquiredmorepurefibroblasts.3,CK19wasexpressedintheouterrootsheatof hairfol