人类风湿性关节炎B型滑膜细胞的分离、培养和纯化研究.pdfVIP

动物实验 第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 人类风湿性关节炎B型滑膜细胞的分离、培养和纯化 黄世峰1，肖长虹2，顾为望1，陈国强3’ (1．南方医科大学动物实验中心1，2．2南方医院风湿科(广州510515)： 3．3佛山市第一人民医院风湿科(佛山528000) 【摘要】 目的 建立一种人类风湿性关节炎滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法。方法关节 镜下钳取膝关节滑膜组织，采用组织块培养法和酶消化法分离滑膜细胞。经台盼蓝拒染计数，将细胞 按3．2×106接种于培养瓶，传代培养。从形态学、光镜、细胞免疫化学、生长特性鉴定细胞类型。结 果反复贴壁和多次消化达到形态学上的纯化要求，纯度达96％以上，活性率为98％，成纤维细胞经鼠 抗人单克隆抗体染色阳性，符合B型滑膜细胞特征。结论本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、培 养和纯化方法。为类风湿性关节炎致病机理的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型。 【关键词】类风湿关节：滑膜细胞；体外培养模型 类风湿性关节炎(rheumatoidarthritiS，RA)是一种以关节滑膜炎症为病理中心的 系统性自身免疫性疾病，全世界发病率约O．4％¨1。炎症性关节炎的一个最明显特征是滑膜 衬里层滑膜成纤维细胞的增生晗3。滑膜成纤维细胞大量增生并形成血管翳是软骨和软骨下． 的骨皮质发生侵蚀的关键因素。应用组织工程学原理，对体外滑膜组织的研究，成为目前类 风湿性关节炎研究热点。本文通过对人类风湿性膝关节滑膜细胞的体外分离、培养和纯化实验 研究，可获得大量较纯的滑膜细胞，能满足滑膜病理研究和动物模型的建立，为临床类风湿关 节炎的诊治提供指导。 l 材料与方法 1．1 材料 一 1．1．1 滑膜组织类风湿性关节炎患者女性38岁，病症符合美国风湿病协会1987年修订的 类风湿行关节炎诊断标准∞。。关节镜下取得患者膝关节的滑膜组织(佛山市第一人民医院风湿 科)，放入DMEM培养基中低温保存。 1．1．2 主要仪器设备 眼科剪、镊、培养瓶、200目不锈钢筛网；离心机、C0：培养 箱(Sigma公司产品)；倒置显微镜(OLYMPUS公司产品)等设备。． 1．1．3 主要试剂 D-Hanks 化试剂盒(Sigma公司产品)：胎牛血清(PAA，奥地利)；DAB试剂盒(北京中山公司)j 液(不含Ca2+、Mg”)及细胞培养的常规化学药品和试剂。 1．2 方法 1．2．1 组织块培养法术中取下的滑膜组织块带入准备好的超净工作台内，剔除表面血污及 lO％胎牛血清和青、链霉素各10万U／L双抗液)培养。 1．2．2 消化培养法滑膜组织剪切15～25min变糊状后，加入5倍组织量的0．2％II型胶原 酶(O．2％C011agenaseII)在培养箱中消化约1～2h，20rain摇晃一次。再加入6倍组织量的含 摇晃一次。镜检见分散成细胞团块或单个细胞时，加入完全培养基终止消化。经200目不锈钢 39l 第七届中南地区宴验动物科技窖氚当证史汇辊 动物窒啦 {|；!【。用“卜字洼轻轻摇晃培莽瓶健细胞均匀分布，置于培养精内培莽。 l 2 3 滑聪细胞活性鉴定、计数取揶胞蘑液9滴^离心管中加1滴lOg／L的台盼蓝液． 吹打混匀．置2·-4min．取l滴于细胞~十数扳上．镜下观察．死细胞被染成浚蓝色．而活细胞 拒搬。根掘下刊公式计算每毫升培荐基中滔细胞数：细胆数，7m1=d太格细胞总教÷d×10’。细 胞活性童=4大格活性细胞总数÷4太格细胞匹数。 l 24 兜镜观察将细胞悬渡=；，别加入21扎扳扎内【孔内可：先置d=lO皿的嘲玻HJ，培养 24h取计。D-Hanks渡清洗，己莳梯度脱水、问定+常坝HE妊色．一甲辆垂明靠圭|同．镜下观 察。 1 2 5 细胞免疫化学 将细胞呈渡加几2q扎板扎内(扎内预先置d=10啪l柏圆玻¨J， 0℃ 化学。滴加一抓鼠