鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-Ⅰ的含量检测.docxVIP

鹿茸、鹿心和鹿血中胰岛素样生长因子的含量检测陈凡波，尹建元，刘竞妍，杨玉霞，孙丹丹，刘继华*（吉林大学药学院，吉林长春130021）摘要：目的对鹿茸、鹿心和鹿血中胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）的含量进行检测和分析比较。方法采用氨-醋酸铵缓冲液超声提取鹿茸、鹿心和鹿血中的IGF-Ⅰ，并利用超滤法和固相萃取法对IGF-Ⅰ提取液进行浓缩与分离纯化，以放射免疫法（RIA）测定鹿不同组织部位中IGF-Ⅰ的含量。结果鹿茸、鹿心和鹿血中IGF-Ⅰ含量差异较大，鹿茸粉中为61.9ng/g，鹿血中的浓度为21.9ng/mL，鹿心中未检出。结论鹿茸中IGF-Ⅰ的含量明显高于鹿血和鹿心，是提取鹿茸IGF-Ⅰ的最佳组织部位。关键词：胰岛素样生长因子-1（IGF-Ⅰ）；放射免疫法(RIA)；超滤法；固相萃取法作者简介：陈凡波（1989-），男（汉族），四川广元人，现为吉林大学药学院在读硕士研究生，学士学位，主要从事天然产物研究工作。*通讯作者简介：刘继华（1972-），女（汉族），吉林长春人，现任吉林大学药学院副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事天然产物化学和药代动力学研究工作。鹿科动物梅花鹿（Cervus Nippon Temminck）和马鹿(Cervuselaphus Linnaeus)药食兼用，药用部位为鹿茸、鹿血和鹿心等，均为我国传统名贵中药与滋补品。鹿茸系梅花鹿或马鹿的雄鹿尚未骨化的幼角，主治阳痿滑精、宫冷不孕[1]等症；鹿心具有改善心脑血管和神经系统的功能[2]；鹿血在心悸、风湿及抗衰老[3]等方面有较好疗效。鹿产品含多种生长因子[4]，其中胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-1, IGF-Ⅰ）为一种极为重要的活性成分，其水平紊乱与肝损伤[5]、胰岛素抵抗和骨骼发育不良[6]等疾病密切相关，近年来受到广泛关注[7~10]，目前已用于治疗骨质疏松症[11,12]，具有较大的临床应用价值。郝林琳[13]等对马鹿茸不同部位IGF-Ⅰ含量进行比较分析，得出IGF-Ⅰ在鹿茸尖部含量最高（27.6ng/g）的结论，但目前国内外尚无针对鹿不同组织部位IGF-Ⅰ含量比较的报道。因此本实验采用超声法提取IGF-Ⅰ，利用超滤浓缩和固相萃取技术对其进行浓缩和纯化，采用放射免疫法（RIA）测定了梅花鹿不同组织部位提取物中IGF-Ⅰ的含量。本实验成果可为梅花鹿产品中IGF-Ⅰ的开发利用提供理论和实践依据，并为梅花鹿产品质量标准的完善提供新的思路。1材料与仪器本实验中采用的鹿不同组织部位均来源于梅花鹿。鹿茸粉购自吉林森宝堂参茸制品有限公司；鹿心和鹿血样品由吉林睿康生物技术有限公司提供；IGF-Ⅰ放免试剂盒，购于天津九鼎医学生物工程有限公司；实验用水为双蒸水，试剂均为分析纯。GC-2016γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司)；TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南省凯达实业发展有限公司)；DFNC-102氮吹仪氮气发生器(杭州德克尔实验设备有限公司)；MD-200-2氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)；BT125D电子分析天平(德国赛多利斯股份公司)；HQ-250D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore超滤管（4mL,10kDa）；Supelco固相萃取柱(500mg, 5ml)。2方法与结果2.1样品溶液的制备2.1.1鹿茸和鹿心样品溶液的制备取鹿茸粉、鹿心粉末各3g，精密称定，分别置于100mL锥形瓶中，分别加入pH10的氨-醋酸铵缓冲液（4mol/L）20mL，超声提取20min，并于-4℃离心10min（8000 rpm），吸取上清液，剩余药渣照上述步骤重复提取一次，合并两次所得提取液，超滤浓缩至2ml，取浓缩液进行固相萃取，上样后以30%甲醇/水溶液洗脱，收集洗脱液，于N2下吹干，残渣分别精密加入蒸馏水1mL溶解，即得鹿茸粉和鹿心粉的样品溶液。2.1.2鹿血样品溶液的制备精密吸取鹿血3mL置于离心管中，按1：1比例精密加入无水乙醇3ml，混匀，静置沉淀，于-4℃下离心10min (8000rpm)，吸取上清液，于N2下吹干，残渣精密加入蒸馏水500μL溶解，即得鹿血样品溶液。2.2对照品溶液的制备取IGF-Ⅰ标准品适量，精密称定，分别加标准品稀释液溶解，混匀，制成浓度分别为10，25，50，100，250，500ng/mL的标准品溶液。2.3IGF-Ⅰ测定方法采用放免法检测，试剂加入程序和操作方法如表1所示。表1IGF-Ⅰ放免法检测加液程序TNSBB0S1-S6样品蒸馏水－100－－－标准稀释液－100100－－标准品－－－100－样品－－－－100抗体－－100100100125I-IGF-Ⅰ100100100100100充分混匀，4℃放置24h分离剂5005005005005