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虎杖甙对炎症状态下多形核白细胞趋化活性调节的机制研究 黄海潇1(3252000025) 赵清1(3252000064 ) 指导老师：金春华2 (1.南方医科大学第一临床学院三班 2.南方医科大学基础医学院实验教学中心,广州510515) 摘要：目的：初步研究虎杖甙对内毒素刺激下白细胞趋化活性调节的机制。方法：观察虎杖甙对LPS刺激下白细胞上清对白细胞趋化活性的影响及PD对LPS刺激下FPRL1/293趋化活性的影响。结果：LPS也可增加PMN趋化因子的分泌，PD可以下调PMN对LPS刺激后PMN悬液上清趋化性的升高。PD同样可以下调LPS刺激下转染了甲酰化肽样受体基因的细胞株的细胞趋化性的升高。结论：PD可以通过抑制白细胞趋化因子的分泌和下调甲酰化肽样受体活性下调白细胞的趋化活性，进而发挥抗感染性休克的作用。 关键词：虎杖甙；趋化作用；内毒素；甲酰化肽样受体；多形核白细胞 近年来在对革兰氏阴性( G-)菌引起中毒性休克的机制研究中，认识到内毒素(endotoxin，LPS)引起休克、造成多器官功能衰竭(MOF)的机理并非由细菌感染直接作用,而是宿主受LPS刺激后体内释放多种内源性细胞因子引起的过度炎症反应的结果[1]。虎杖甙（Polydatin,PD）是从具有清热解毒、凉血行淤功能和抗病毒、抗菌作用的中药虎杖中提取的主要成份，对烧伤性、感染性和失血性休克有良好疗效。近来的工作证实[2]PD在炎症状态下对细胞趋化性的调节可以使炎症反应和抗炎症反应趋于平衡。但其调节细胞趋化性的具体机制尚不明确，为了进一步探讨PD的作用机理，我们用趋化性分析的技术观察了PD对正常及LPS刺激下白细胞分泌趋化因子及白细胞膜上甲酰化肽受体异构体（formyl peptide receptor like-1）活性的影响。 1 材料与方法 1.1材料： 1主要试剂与仪器：fMLP、LPS 购自Sigma公司；DMEM、RPMI-1640为美国GIBCO产品；小牛血清为杭州四季青公司产品。PD由深圳海王制药公司提取；牛血清白蛋白购自上海伯奥生物科技有限公司；糖原购自中国医药集团上海化学试剂公司； 其余为国产分析纯产品。趋化实验装置和趋化膜购自NeuroProbe公司，由美国王吉明博士提供。 1.1.2 稳定表达FPRL1的293细胞株（FPRL1/293）由美国王吉明博士提供。 1.1.3 趋化缓冲液（binding medium, BM）: 含终浓度为1%BSA、30mmol/L HEPES、20mmol/L Glutamine、200units/L Penicillin和200μg/L Streptomycin的RPMI-1640。 1.1.4 实验动物: SD大鼠，体重180~200g，清洁级，由第一军医大学实验动物中心提供。 1.2 中性粒细胞的制备：用糖原生理盐水腹腔注射的办法分离PMN[3]。 1.3 PMN悬液上清的制备：获得的PMN以趋化缓冲液重悬，分为5组进行处理：1）不进行任何处理；2）按所需终浓度加入1mg/ml的LPS处理30分钟；3）在30分钟后按所需终浓度加入8mg/ml的PD孵育30分钟；4）先按所需终浓度加入1mg/ml的LPS，30分钟后按所需终浓度加入8mg/ml的PD孵育30分钟。处理后分别以2500rpm离心5分钟，取上清，细胞再以趋化缓冲液重悬，调整细胞浓度为2×106/L备用。 1.4PD对LPS刺激下PMN分泌趋化性细胞因子的影响趋化性的检测及实验分组： 1.4.1 细胞趋化性的检测：趋化活性的检测方法用趋化小室法[4]。 1.4.2 实验分组：（1）空白对照组：下孔为单纯的趋化缓冲液；（2）阴性对照组：下孔为未加任何刺激的PMN悬液上清；（3）LPS刺激组：下孔分别为终浓度10、100、1000ng/ml LPS处理30分钟后PMN悬液上清；（4）PD处理组：下孔分别为不同终浓度PD处理30分钟后PMN悬液上清；（5）PD治疗组：下孔为LPS孵育30分钟后再以PD处理30分钟后PMN悬液上清。 1.5细胞甲酰化肽样受体FPRL1对细胞趋化性的影响的趋化性检测及实验分组： 实验分为4组，除空白对照组下层为单纯趋化缓冲液外，其余各组下层小孔内均为浓度为10-7mol/L的fMLP，具体分组如下：（1）空白对照组：趋化小室上层为293或FPRL1/293细胞；（2）正常组：趋化小室上层为未做任何处理的293或FPRL1/293细胞；（3）LPS组：上层为100ng/ml LPS刺激30分钟的293或FPRL1/293细胞；（4）PD组：上层为在LPS刺激组基础上又以0.08mg/ml PD处理30分钟的293或FPRL1/293细胞； 1.5 统计方法：结果用平均数±标准差表示，应用SPSS 10.0统计软件进