5DNA、RNA及蛋白质操作技术.ppt

5. 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术 5.1 重组DNA技术回顾 分子生物学的三大成就：①40年代确定了遗传信息的携带者；②50年代提出了DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制；③60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，破译了遗传密码。 重组DNA和核苷酸序列分析技术推动了分子生物学的发展，重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。 限制性内切核酸酶 （restriction endonuclease，RE）是能够识别DNA上的特定碱基序列（4~8bp，回文结构），并在识别位点或其周围切割双链DNA分子的一类内切酶，产生具有粘性末端或平末端的片段。 DNA的酶切反应 1) 建立反应体系 2) 轻弹外壁以混匀，并短暂快速离心，使液体沉下。 3) 将混合反应物置于37℃水浴锅中，反应1-3小时。 4) 电泳观察酶切结果。 DNA连接酶：通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，修复缺口或催化黏合完全分离的两个DNA片段。 类型：大肠杆菌DNA连接酶、噬菌体T4 DNA连接酶。 连接反应 1) 建立反应体系，轻弹外壁以混匀，短暂快速离心，使液体沉下。 2) 4℃或16℃连接过夜。 获得了外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA后，还要通过细菌转化将重组载体导入宿主细胞（E.coli），让重组载体增殖。 5.2 DNA基本操作技术 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 5.2.3 聚合酶链反应技术 5.2.4 实时定量PCR 5.2.5 基因组DNA文库构建 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 原理：某种分子放到电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。迁移率：这种分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数（分子大小、极性、介质黏度的函数）成反比。 迁移率取决于分子大小和构型。相同分子量的超螺旋环状DNA迁移率＞线性DNA ＞开环DNA。 类型：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从海藻产物琼脂中提取而来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成电泳介质，密度由其浓度决定。 聚丙烯酰胺是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成。 电泳缓冲液：TAE、TPE、TBE，作用：①稳定体系的pH值；②使溶液具有一定的导电性；③EDTA可螯合Mg2+，抑制DNA酶活性，还可防止Mg2+与核酸生成沉淀。 载样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液。作用： ①增加样品密度； ②使样品带颜色； ③可预测泳动速率。 Marker：分子量不同的DNA片段， 作用类似于标尺。 步骤：封胶板，插梳子→配胶→加EB→灌胶→胶凝后放入电泳槽，加缓冲液，拔梳→加样→插电极→电泳→取胶→观察照相 琼脂糖凝胶电泳中，加入适量溴乙啶（EB）染料，EB是扁平分子，能插入到核酸分子的相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。荧光强度与DNA片段的大小成正比。 聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳后用硝酸银进行染色。 Ag+先与核酸形成复合物，再用甲醛使Ag+还原为银颗粒而呈现黑褐色。 脉冲场电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE） 对于50kb的DNA分子，用脉冲电场凝胶电泳（PFGE）进行分离。 用交替变换方向的两个电场施加在凝胶上，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变，重新定向时间小于电场变化周期的DNA分子将按其大小被分离。 可分离高达107的DNA分子，用于研究基因组、克隆和分析大的基因片段。 5. 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.1 重组DNA技术回顾 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 5.2 DNA基本操作技术 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 原理：迁移率与DNA分子大小和构型有关。 类型：琼脂糖、聚丙烯酰胺、脉冲场凝胶电泳 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。 进入宿主细胞的外源DNA通过自身载体上的Ori进行复制增殖，使其能够在宿主细胞中保持下来，并能以完整的形式从细胞中分离纯化出来。 细菌正常条件下仅能获取极少量的DNA，为了高效转化，必须对受体细菌进行理化处理，增加它们获取DNA的能力，处理过的细胞称为感受态细胞。 转化方法：CaCl2法（热击法）和电击法。 Ca