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实验三 底物浓度对酶促反应速度的影响 石陆娥 shilue@126.com 实验目的 （1）了解底物浓度对酶促反应的影响。 （2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法。 实验原理 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示： Linewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测Km值的最常用的简便方法： 实验时可选择不同的[s]，测定对应的v，以 对 作图，得到一个斜率为 的直线，其截距 则为 ，由此可求出Km的值（截距的负倒数）。 本实验以实验一制备的过氧化物酶为研究对象，考察底物浓度对酶促反应速度的影响。 实验试剂 1、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 pH7.0，含 1.0mol/L NaCl (缓冲液Ⅰ) 2、0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 pH7.0 (缓冲液Ⅱ) 3、1%邻苯二胺-乙醇溶液 4、3%过氧化氢溶液 实验步骤 按表格顺序分别加入溶液，加入酶液后立即搅匀计时，转入比色皿中，分别于反应2.5min、5min后在 430 nm下测定反应混合物的吸光值。空白以缓冲液代替酶液。根据吸光值变化情况调节酶液稀释倍数。 数据处理：以吸光值为纵坐标，底物浓度为横坐标作出吸 光值-底物浓度曲线。 注意事项 （1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 （2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此，配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。 思考题 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 米式方程中的Km值有何实际应用？ * 式中： v——反应初速度（微摩尔浓度变化/min）； V——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）； [s]——底物浓度（mol/L）； Km——米氏常数（mol/L）。 这个方程表明当已知Km及V时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶，Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：Km值越大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。则测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01～100mmol/L。 （5.0min）OD430 （2.5min）OD430 0.1mL 酶液 0 0.1 0.14 0.16 0.18 0.19 蒸馏水mL 0.2 0.1 0.06 0.04 0.02 0.01 3%过氧化氢溶液mL 0.1mL 邻苯二胺-乙醇溶液 2.6mL 缓冲液Ⅱ 6 5 4 3 2 1