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第十二章 遗传工程 一、遗传工程的概念 遗传工程（genetic engineering）是七十年代发展起来的一门新技术，它是综合分子生物学与微生物学、分子遗传学等理论和技术建立起来的。 广义：基因工程、细胞工程、染色体工程和细胞器工程。 狭义：基因工程 1、基因工程(gene engineering)： 不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室操作技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。 基因克隆与表达 转基因动植物 2、 基因工程的优越性 传统杂交只能进行亲缘关系较近的交配（远缘交配失败），无法进行远缘交配（即遗传物质交流），遗传物质交流开始是全方位的，通过人为对性状选择，达到改良目的，但工作量大，且容易改变其他原有优良性状 基因工程不但可以进行种间、属间科间遗传物质交流，还可以进行高等、低等，动物与植物间遗传物质交流，同时可以定向而不改变原来的优良性状 3、基因工程主要在以下几方面应用 a. 生物制药 b. 遗传病治疗:疾病动物模型 c. 农业新品种选育 d. 发酵工程 e. 治理环境污染(创造微生物新类型) 4. 基因工程施工的程序 （1）. 施工准备材料, 即目的基因，载体和工具酶等。 （2）. 把目的基因与载体连接成重组DNA （3）. 把重组DNA分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖或称克隆。 （4）. 鉴定筛选携带并表达了目的基因的个体和家系 二、基因工程的四大要素及实施要点 （一）目的基因的克隆（分离） 1.化学合成 1970年Khorana首次合成酵母丙氨酸tRNA的基因 1976年合成第一个有生物活性的基因，大肠杆菌酪氨酸tRNA的基因 基因化学合成首先要了解该基因的核苷酸顺序，然后才能合成。 2. PCR扩增：已知基因的全部或部分序列时，可根据已知序列设计引物扩增目的基因 PCR的四大要素： 模板DNA：含有目的基因 引物：根据已知序列设计 dNTPs: dATP dCTP dTTP dGTP 合成DNA的原料 Taq DNA聚合酶及其缓冲液：Mg2+ PCR扩增的反应条件和步骤： 预变性：94~95oC 5分钟 变性：94~95oC 1分钟 复性：30~68oC (根据引物Tm确定) 0.5~2分钟 延伸：72oC 0.5~2分钟 (根据扩增片断长度确定) 3.逆转录PCR(RT-PCR) ●cDNA：互补DNA (complementary DNA) ●从cDNA文库中获得全长目的基因 某一时期特定组织基因转录形成的mRNA总体反转录成cDNA，这些cDNA全部克隆就称为cDNA文库。 从cDNA文库中获得目的基因需要用标记探针对其进行杂交和筛选， 用目的基因片断制备探针（PCR或克隆） 用放射性或者荧光物质标记探针 与cDNA文库杂交，获得阳性克隆 扩增分离完整目的基因 4. 从基因组文库中分离 ●基因组文库：将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段同相应的载体连接、克隆，所产生的克隆群体代表基因组DNA的所有序列。 从基因组文库中可以筛选获得完整的基因组DNA序列（包括内含子） 常用构建基因组文库的载体和宿主主要有： BAC(bacterial artificial chromosome)细菌人工染色体，以细菌作为宿主，将DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。 YAC(yeast artificial chromosome)酵母人工染色体 ，以酵母作为宿主。 PAC(P1 artificial chromosome)噬菌体人工染色体, 以噬菌体作宿主 (二)重组DNA的建立 为了实现基因转移，首先需要限制酶将“目的”基因安装在一个特定的运载工具——载体DNA上，在载体DNA的运载和保护下，被转移的基因可以通过适当方法顺利进入受体细胞，在受体细胞中复制、 扩增，最后整合到染色体上，达到稳定表达。 1. 运载工具----载体 ●作为运载工具的条件 〇在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地将所携带的外源DNA在受体细胞内忠实地复制。 〇有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因，并能嵌入外源DNA的片段。 〇具有可作为重组DNA分子选择标记遗传标记。 ●原核生物载体的种类 有多种载体，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。 〇质粒载体：环状DNA，大小1kbp到200kbp。以细菌质粒（