Western Blot试剂与方法.docVIP

细胞/组织蛋白提取和Western Blot 2010.03.06 1、in vitro蛋白提取和电泳样制备 1.1煮沸法 速度最快，操作简单，蛋白保存较完整 操作步骤： 1、用PBS洗细胞1-2次。 在细胞培养皿/板上直接加入1*样品buffer。 *buffer用量：6孔板 80~300μl/孔；10cm大皿 200~500μl/皿 用细胞刮刮取细胞。 -80℃~37℃循环冻融3次。 *-80℃约2min，只需要样品刚好冻结即可；3℃7水浴10min。 沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80℃。 1.2反复冻融法 对于小分子量蛋白提取较有利 试剂：PBS、cocktail液、sample buffer 器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、37℃水浴锅、沸水浴、冰盒 操作步骤： 1、用PBS洗细胞1-2次。 2、在细胞培养皿/板上直接加入含cocktail的PBS（1：200）。 *buffer用量：6孔板 80~300μl/孔；10cm大皿 200~500μl/皿。 3、用细胞刮刮取细胞，转移至对应离心管中。 4、-80℃~37℃循环冻融3次。 *-80℃约2min，只需要样品刚好冻结即可；3℃7水浴10min。 离心10 000r，4℃，10min，取上清。 6、加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80℃。 1.3裂解液裂解 1.3.1提取总蛋白 试剂：PBS、细胞裂解液（如RIPA等）、cocktail液、sample buffer 器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒 操作步骤： 1、用PBS洗细胞1-2次。 2、在细胞培养皿/板上直接加入含cocktail的裂解液（1：200）。 *裂解液用量：6孔板 80~300μl/孔；10cm大皿 200~500μl/皿。 3、用细胞刮刮取细胞，转移至对应离心管中。 离心10 000r，4℃，10min，取上清。 加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80℃。 1.3.2提取核蛋白 试剂：PBS、bufferA、bufferB、cocktail液、sample buffer 器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒 操作步骤： 按照配方配制了bufferA和bufferB。 1ml冷PBS刮取1~20*106细胞，常温离心10 000r，10s，小心弃上清。 400~600μl bufferA重悬沉淀，置于冰上裂解细胞，10min。 剧烈震动10s（speed5-6，频率很重要），将离心管放回冰上，常温离心10s，尽量完全弃上清。 向沉淀中加入30~50μl 预冷bufferB，冰浴20min。 离心10 000r，4℃，10min，将上清转移至洁净离心管中，剩余数微升，测定蛋白含量（核蛋白浓度大约2-3mg/ml）。 将10-20μl置于冰浴（dry ice）上冷冻后，保存于-20℃ *要求提取速度尽量快，一次提取平行样不超过6个。 *但我做了几次，发现沉淀粘糊糊的一块，不能溶解在bufferB中，那么如何才能提出核蛋白呢，郁闷！ 还有一个问题想请教，提取蛋白一定需要液氮研磨成粉状然后转移到裂解液中吗？我是直接在研钵中利用裂解液研磨组织，然后用枪吸到离心管中离心的，这样有问题吗？ 加了B后沉淀不会全溶的，那种情况正常。测一下蛋白浓度，很高的。 2、in vivo蛋白提取和电泳样制备 试剂：PBS、细胞裂解液（如RIPA等）、cocktail液、sample buffer 器材：移液器及对应枪头、细胞刮、1.5ml离心管、冷冻离心机、沸水浴、冰盒 操作步骤： 将组织样品称重后，按5-10%（w/v）比例准备好组织匀浆液。 *匀浆液可以为PBS或细胞裂解液（按1：200体积比加入cocktail） 2、将样品置于匀浆器上部球状凸槽内，用手术剪剪碎，用移液器加入匀浆液将组织碎片冲入匀浆管中，于冰上匀浆3-5min。 3、将匀浆液用移液器移至合适规格的离心管中（一般为1.5ml），离心10 000r，4℃，10min，取上清。 4、加入sample buffer，沸水中煮样5min，将样品取出，置冰盒上冷却后，分装，冻存于-20/-80℃。 *本人在2010年初实验采用预冷的PBS+cocktail作为匀浆液匀浆，WB效果也很好。 3、蛋白浓度测定 Bradford法操作简单，实验周期短。 Lowry法测定更加精确。 3.1 Bradford法 试剂：Bradford工作液、蒸馏水、标准蛋白（如BSA） 器材