基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译.docxVIP

基本的银染步骤：（90min）材料：超纯水（18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）注意事项：1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。2.用干净的容器，并标明银染专用。3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。6.避免试剂交叉污染。7.用新鲜配置的溶液。样品含有高浓度的DTT：如果你的样品含有高浓度的DTT（50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品：1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min.2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min.3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。进行电泳，并按手册进行银染。在开始之前：用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：敏化液：乙醇30mL敏化剂（sensitizer）10mL超纯水至100mL染液染料（stainer）1mL超纯水至100mL显影液显影剂（developer）10mL显影剂增强剂1滴超纯水至100mL注意：在实验中即刻完成配制。程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。确保每个胶有100ml的溶液。1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。如果你用的是Tricine胶，那么就固定1小时。注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。3. 倒出固定液，用30%乙醇洗胶10min。4. 倒出乙醇，加入100ml敏化液，孵育10min.5. 倒出敏化液，100ml 30%乙醇洗胶10min.6. 用100ml超纯水洗胶10min.7. 用100ml 染色液孵育胶15min.8. 染色完成后，倒掉染色液，用100ml蒸馏水洗胶20-60秒。注意：如果洗胶超过1min会使银离子减少，影响灵敏度。9. 在100ml 的显影液中孵育胶4-8min，直到条带开始出现，想要的条带强度达到。10. 当适当的染色强度达到后，立刻加入10ml终止液（stopper）（胶仍然浸没在显影液中）。轻轻摇动胶10min。颜色从粉红色到无色说明反应终止。11. 倒掉终止液，用100ml超纯水清洗胶10min。银染考马斯亮蓝染色后的胶：1. 用超纯水彻底的清洗gel 10min。2.同银染步骤。可能得到的背景比较深。快速染色方案：注意：用微波染色，小心着火，将盖子盖松些，可以减少着火的概率。材料：超纯水、微波染色托盘、微波炉、摇床、塑料棒、10ml一次性管、干净的玻璃杯、刻度量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸）用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染：敏化液：乙醇30mL敏化剂（sensitizer）10mL超纯水至100mL染液染料（stainer）1mL超纯水至100mL显影液显影剂（developer）10mL显影剂增强剂1滴超纯水至100mL注意：在实验中即刻完成配制。8*8cm预制胶，1mm厚；用100ml。1. 电泳后，将胶至于可以微波的容器中，用超纯水清洗干净。2. 到入100ml 固定液，微波高档（700W）30s。取出后室温下轻轻搅动5min。倒掉固定液。3. 100ml 30%乙醇洗胶，H档30s。取出后室温下轻轻摇5min。倒掉乙醇。4. 加入100ml 敏化剂，H档30s。轻轻摇2min。倒掉敏化剂。敏化液：乙醇30mL敏化剂（sensitizer）10mL超纯水至100mL5. 用100ml超纯水洗两次胶，H档30s，摇2min。6. 加入 100ml染色液，H档30s。取出后室温下轻轻摇5min。染液染料（stainer）1mL超纯水至100mL7. 倒掉染色液，用100ml超纯水洗20-60s。不要超过1min!8. 加入100ml 显影液，直接摇床孵育5min。（不微波）显影液显影剂（developer）10mL显影剂增强剂1滴超纯水至100mL9. 当想要的条带出现后，立刻加入10ml 终止液。轻轻摇10min,颜色从粉色变为无色。1