天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的分泌表达.pdfVIP

I015 天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的分泌表达 李霜 张宏志 林涛 何冰芳* （南京工业大学制药与生命科学学院，南京，210009 ） 摘 要 本文以大肠杆菌JM109 基因组DNA 为模板，PCR扩增天冬氨酸转氨酶基因AspC ，以 pET-22b为表达载体，以载体自带的pelB为信号肽，构建分泌型重组表达载体，经PCR及限制性内 切酶酶切验证阳性克隆，重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3) ，IPTG诱导目的基因表达，经过检 测，发酵液上清天冬氨酸转氨酶酶活为23.4µmol PPA·h-1·mL-1 ，但菌泥酶活近39µmol PPA·h-1·mL-1 ， SDS分析表明目的蛋白与信号肽呈融合蛋白表达(约 45kDa) ，具有较高的表达量，但目的 蛋白与信号肽未能较好的识别并剪切。 关键词 L-苯丙氨酸 分泌表达 天冬氨酸转氨酶 pET-22b THE SECRETED EXPRESSION OF ASPARTATE TRANSAMINASE IN ESCHERICHIA COLI LI Shuang ，ZHANG Hongzhi ，LIN Tao and HE Bingfang (College of Pharmacy and Life Science, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009) Abstract In this paper , the aspAT (encoded by aspC) gene fragment was amplified by PCR using E.coli JM109 genome DNA as template . The expression vector pET-22b(+) (produced by Novagen ) was digested at restriction sites with NcoI and HindIII, so that the leader sequence of pET-22b(+) can be used to express the fusion protein to export into the periplasmic space. The recombinant clones were identified by PCR , digest with NdeI and HindIII . The target protein aspAT was induced by IPTG . The activity of aspAT in the supernatant was 23.4µmol -1 -1 -1 -1 PPA.h .mL ,while in the cell pellet the activity of aspAT was 39.4µmol PPA.h .mL .The results of SDSanalysis showed the target protein aspAT expressed as fusion protein with signal peptide. Key words l-phenylalanine ，secreted expression，aspartate aminotransferase，pET-22b(+) 引 言 L-苯丙氨酸（L-Phe ）是氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分，也是合成一些抗癌药 物的中间体和良好载体，特别是作为甜味剂阿斯巴甜的前体，具有巨大的市场潜力。利用天 冬氨酸转氨酶（AspAT ），由苯丙酮酸(PPA)生产L-Phe是目前国内外L-Phe工业生产的常用方 法。该反应是生物体正常生物合成L-Phe途径的最后一步，即以L-天冬氨酸（L-Asp ）作为氨 基供体，与苯丙酮酸（PPA ）反应生成L-Phe和草酰乙酸，后者可脱羧为丙酮酸和CO2 ，使该 反应趋于完全。 利用具有天冬氨酸转氨酶的常规菌株生产L-Phe 的研究较多[