细胞组分的分析方法——定量细胞化学分析技术一流式细胞光度术.PDF

中国试剂网 3.8.3.22 细胞组分的分析方法——定量细胞化学分析技术 一.流式细胞光度术－单细胞悬液染色标本的多信息分析法 1.概述 流式细胞光度计(flowcytometry)可定量地测定某一细胞中的 DNA 、RNA 或 某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，特别是 它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将 DNA 含量不同的中期染色体分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。 细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异染色，然后将悬液中的 细胞以 1 个细胞 ／ms 的速度(1 000 万细胞/h)一个个地通过流式细胞仪，此时检 测器便可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量，并根据要求将该成分含量不 同的细胞分离出来。如果染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以 继续培养。 2.工作原理 流式细胞光度计(简称 FCM)是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ— 射线能谱术 及电子计算机等新技术与显微荧光分光光度计密切结合的高度精密仪器。在电子 计算机操作 程序控制下能灵敏而快速地对大量单细胞样品进行多信息分析与测 定。目前，FCM 技术已广泛地应用于生命大分子物质的定量、细胞周期分析、 细胞表面抗原、受体、染色体、核浆比例、活细胞分类等细胞生物学各领域的研 究工作中。 其主要工作原理是：经荧光染色的单细胞悬液被高压压入流动室内，在PBS 或生理盐水等壳液(Sheath Fluid) 的包裹和推动下形成单细胞状态，并以每分钟 5000—10000 个细胞的高速度从流动室内喷出。在与细胞束呈 90°角的方向，受 到来自氩离子激光器的激光束照射而激发荧光。通过各种物镜及滤光片将从不同 角度收集的荧光投射到光电倍管并转换为各种强弱不等的电脉冲信号显示出来。 这些信号输到电子计算机中贮存，经处理和分析便可得到多种信息参数。进行细 胞分类时，根据需要对含细胞的水滴选择性充电，在带有高电压的偏转板作用下， 带正电荷的水滴落入左方收集管内，带负电荷的水滴落入右方收集管内，不带电 荷的水滴进入中间的收集管。分类主要根据细胞的荧光强度，即单细胞DNA 含 中国试剂网 3.8.3.22 量。 3.FCM 系统调试： 以 FACSⅢ型机为例，调试的原则是：得到较高的分辨率，即对某一特殊样 品测得的变 化常数 CV 值，CV 值越小越好。得到较高的灵敏度，即可测出最小 荧光分子数。 调试仪器要有理想的标准品，其条件是：①稳定；②颗粒大小和荧光性要均 匀；⑧标准 品本身的 CV 值要低于仪器的 CV 值；④易得，易制成悬液。目前 常用的标准品有：④荧光 微球，⑥鸡红血球悬液，它易得，制备方法简单，易 保存，且血红蛋白可自发荧光。 4.样品制备过程 着重介绍单细胞悬液的制备方法，这是生物学工作者最为关心的问题。悬液 培养样品或 各种腹水细胞本身就是单细胞悬液，可直接使用。下面介绍单层培 养样品及实体组织的制备方法。 Ⅰ 酶法：应用最广泛的是胰蛋白酶。 (1)单层培养的样品：器材和试剂：玻璃滴管数只(灭菌) ；5ml 移液管 5 只(灭菌) ； 10ml 移液管 3 只(灭菌) ；离心管数只(灭菌) ；灭菌超净台；恒温水浴箱；离心机、 冰箱；PBS 液(灭菌) ；胰蛋白酶溶液。 步骤：①去掉培养基；②用 5ml 冷 PBS 滴轻轻冲洗细胞后去掉；⑧加 2 毫升胰 蛋白酶液，37℃保温 5 分钟，轻轻摇动培养瓶或用滴管吹盯数次使细胞最大程度 游离；④加 8ml 含血清的培养基以抑制酶活性，⑤把细胞悬液移到离心管内，250g 离心 5 分钟；⑥弃上清，将细胞重新悬于 10ml 冷 PBS 中，搅匀；⑦250g 离心 5 分钟，弃上清加 5ml 乙醇固定，保存于4 ℃备用。 (2)实体组织：器材和试剂：眼科剪、眼科镊各一把；50ml 小烧杯数个；玻璃滴 管数只；小块双层纱布；普通光学显微镜；恒温水浴箱；离心机；Hank’s 平衡盐 水；分离液；中和液。 步骤：①将组织块剪碎，以 Hank’s 平衡盐水洗去红细胞；②加分离液，37℃水 浴，轻轻搅拌直到液体混浊；⑧在显微