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聚丙烯酰氨凝胶电泳 　　 聚丙烯酰氨凝胶电泳 　　作用：用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。 　　作用原理 　　聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 　　而SDS仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 　　SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 　　SDS一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 　　浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 　　此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 一.所需仪器设备1.电泳仪2.垂直电泳槽3.转移电泳槽:湿转或半干转电泳槽4.硝酸纤维素膜(NC膜)5.暗盒6.5x7cm X胶片[注：电泳槽、玻璃板、梳子及胶条的清洗：自来水冲洗数次――去离子水冲洗数次2次――37C烤干备用。]二.所用试剂[注：配制及稀释试剂均用去离子水，实验器皿自来水清洗完毕再用去离子水冲洗]1.Lysis buffer：RIPA 三去污剂裂解缓冲液50mM Tris.Hcl????????????????????????????????? 3.03g150mM NaCl 生理盐水?????????????????????????? 4.35g0.02%NaN3（防腐剂，可以不加）????????????????? 0.1g0.1%SDS 强阴离子去污剂??????????????????????? 0.5g1% NP-40 去污剂??????????????????????????????? 5ml0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠去污剂??? 2.5g配制500ml,10M盐酸调PH8.0, 4度保存。使用前按1：50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟，平时放-20度)和proteaseinhibitor(先溶在2ML水中，分装在小管中，保存在-20度)，配好后马上使用。也可分装成(RIPA300ul+6ul100mMPMSF+6ulprotease inhibitor)(培养细胞及微小组织蛋白提取)若干管，-20度保存；分装成(RIPA1000ul+20ul100mMPMSF+20ulprotease inhibitor)(较大组织蛋白提取)若干管，-20度保存。[注：也可使用单去污剂裂解缓冲液，将1% NP-40换为1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate去氧胆酸钠]PMSF储存液 100mM(17.4mg/ml)，溶于异丙醇。有效浓度100ug/ml。2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理盐水)3.0.1mg/mL考马斯亮兰G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考马斯亮兰G-250,再加入100ml85%磷酸，加水至1000ml。用Whatman滤纸过滤后，置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脱色。4.考马斯亮兰脱色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去离子水。5. 0.25%考马斯亮兰R-250溶液 染色用。100ml脱色液中加入0.25g考马斯亮兰R-250。6.10mg/mlBSA，称取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml灭菌去离子水中。置-20度冰箱保存。7.1mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH6.8