腺病毒载体介导的外源绿荧光蛋白基因在鸡胚成纤维细胞中的表达研讨.pdfVIP

腺病毒载体介导的外源绿荧光蛋白基因 在鸡胚成纤维细胞中的表达研究’ 傅安静，岳华#，李定霏，马莉 (西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041) [摘要] 表达情况和流式细胞仪测定GFP表达效率。结果发现，重组腺病毒能够感染鸡胚成纤维细胞并能在其上表达所带的外源 GFP重组腺病毒载体对鸡胚成纤维细胞的增殖无明显影响。 [关键词]绿荧光蛋白#重组腺病毒，鸡胚成纤维细胞；表达 GreenFluorescentProtein(GFP)基因是1974 USA)；C02培养箱(ThermoformaUSA)；25ml细 年从研究水母的发光机制中发现的，其显著特点是 胞培养瓶、24孔、48孔细胞培养板，购自Corning公 能在不加外源物质的情况下，受紫外光激发，就能在 司(USA)。 原核和真核活细胞中发出绿色荧光，且荧光性质稳 1．2方法 1．2．1 定。‘作为一种理想的活体标记分子，GFP已广泛应 Ade—GFP在293细胞中的增殖与效价测 用于对活细胞的各种研究中[1-6]。腺病毒载体是目定‘11] 前最具应用潜力的载体之一，其具有宿主范围广、能 1．2．1．1待细胞培养瓶中293细胞长成单层时，接 高效感染分裂细胞和非分裂细胞，易制备及纯化，滴 度高，容量大．携带的外源基因不整合到宿主染色体 察细胞及荧光情况；当细胞产生病变，完全脱落后， 中，避免了插入突变的危险[7]，以受体介导的内吞作 一70。C／+37℃反复冻融细胞，离心取含病毒的上清 用进入细胞，并具有效的逃避细胞囊泡系统捕获的 液，一次性滤器过滤后一20℃保存备用。 特异机制；转进去的基因都能有效地高水平表达，成 1．2．1．2将293细胞传代培养在24孔细胞培养板 为表达和传递基因的主要候选者之一[8-1引。本试验 目的旨在观察GFP重组腺病毒能否感染鸡胚成纤 维细胞以及其介导的GFP基因能否在鸡胚成纤维 细胞中的表达，表达是否有规律，且通过表达效率的 培养板中，每个样本设8个重复与8个对照。于 测定，证实其体外转染效率是否高且使用是否安全， 37℃5％C0。培养箱吸附30min，换维持液继续培 为探索在鸡胚原代细胞中进行外源基因的转导、鸡 养18--一24h； 的功能基因组的研究、RNA干涉研究等奠定基础。 ，1．2．1．3荧光显微镜下计数GFP阳性细胞，按空斑 形成单位公式计算病毒滴度； 1材料和方法’ 病毒滴度=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数／ 1．1材料及设备293细胞由南京农业大学芮荣博 0．2ml(pfu／m1) 1．2．2 士惠赠；GFP重组腺病毒载体(Adenovirus—GFP，CEF的继代培养将CEF原代细胞培养在 Ade—GFP)由华西医科大学第一附属医院构建； 25ml细胞培养瓶中，当其覆盖到培养瓶面积80％ Hank’s液；胰蛋白酶；DMEM高糖培养基购自一90％时，弃去培养液，用无钙镁的Hank’s液润洗 1—2次，加胰蛋白酶消化后再加含10％FBS的 Sigma公司(USA)；9～11日龄鸡胚，购自四川省原 种鸡场；荧光倒置显微镜(OlympusIX71，Japan)；DMEM培养液中止消化，吹打分散计数，以l×105 EPICSELITE coulter， ESP流式细胞仪(Beckman个细胞／孔48孔培养板中种植CEF，，置37℃5％ ·作者简介：傅安静(1976年一)、男、汉族、现西南民族大学预防兽医专业硬士研究生．研究方向：微生物及病原分子生物学． #通讯作者