基因芯片技术对非综合征型耳聋基因突变的检测.docVIP

精品论文 参考文献 基因芯片技术对非综合征型耳聋基因突变的检测 阿曼古丽middot;牙生 朱有森 杨立 (通讯作者) (新疆医科大学第一附属医院医学检验中心 新疆乌鲁木齐 830011) 【摘要】 目的:应用遗传性耳聋基因芯片对非综合征型耳聋患者进行分子病因学检测，评估其在遗传性耳聋快速基因诊断中的可行性。方法：采集96例耳聋患者外周血，提取基因组DNA，遗传性耳聋基因芯片检测中国人中常见的4个耳聋相关基因的9个突变,即GJB2(35delG,176dell6bp，235delC及299delAT)、GJB3(C 538T)、SLC26A4(IVS7—2Agt;G、2168Agt;G)和线粒体DNA 12S rRNA(A1555G、C1494T)。结果：96例耳聋患者共检出16例携带致聋突变(16.67％)。其中GJB2基因突变9例(9.38％)、SLC26A4基因突变7例(7.29％)、未检出GJB3基因突变和线粒体DNA 12S rRNA基因突变。结论：遗传性耳聋基因芯片技术对中国人常见耳聋相关基因热点突变的检出率高，具有快速、准确、高通量、低成本等特点，能够满足临床耳聋基因检测的要求，具有广阔的临床应用前景。 【关键词】 耳聋 基因突变 基因芯片 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）15-0041-01 耳聋是最常见残疾之一, 我国现有耳聋人数约2004万, 新生儿耳聋的发生率为0.1%～0.3%[1], 其中约50%属遗传性耳聋[2]。在70%-80% 的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变[3]。国内耳聋分子流行病学研究表明，我国大部分遗传性耳聋主要由为数不多的几个基因突变引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4以及线粒体12S rRNA 等[4、5]。由于遗传性耳聋遗传异质性强、突变位点多，以及人群患病率及携带致病基因比例高，建立快捷、高通量的基因诊断方法十分必要，传统的检测方法（如RFLP、DHPLC、测序等）均很难做到同时检测不同基因或同一基因的不同突变位点。而基因芯片技术以其固有的平行高效的检测特点，有望成为一种极具潜力的耳聋基因诊断和筛查工具。在本次研究中，我们使用了遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒检测96例非综合征型耳聋者，以评价基因芯片技术应用在遗传性耳聋基因快速检测的实用性和可行性。 1 材料和方法 1.1 材料 研究对象全部来自新疆医科大学第一附属医院和新疆维吾尔自治区人民医院，共96例，全部为非综合征型耳聋患者，年龄从1岁-55岁。经知情同意后，对所有研究对象进行病史调查，包括患者一般信息、耳聋发病年龄、家族史、个人史(耳聋前传染病史，耳毒性药物应用情况，头部外伤史等)、患者母亲孕期情况和体格检查等。晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒、微阵列芯片扫描仪及相应的遗传性耳聋基因芯片判别系统等均为博奥生物有限公司产品，全血基因组DNA提取试剂盒为QIAGEN公司提供。 1.2 方法 1.2.1 标本：采集外周静脉血5ml(枸橼酸钠抗凝)，用全血核酸提取试剂盒提取全血基因组DNA。 1.2.2 PCR反应：9个突变位点的9组引物分成A和B两个反应体系分别进行多重PCR，在每个反应体系中加入待测全血基因组DNA(浓度100-200ng/u1)3ul，扩增引物混合物12.5ul，扩增试剂混合物4.5ul。 PCR反应程序：37℃ 10min，95℃15min，96℃1 min预变性，94℃ 30s、55℃30 s、72℃45s共32个循环，70℃ 45s，60℃l0min。 1.2.3 杂交：PCR产物95℃变性10min后，立即浸入冰水混合物中冰浴3min。从同一样品模板的两个不同扩增体系管(A、B)中各取2.5 ul PCR产物加入到10 ul杂交缓冲液管中。将14 ul杂交混合液加到芯片的微阵列区域，加盖玻片，封闭杂交盒，然后放入50℃预热杂交箱中保温l h。 1.2.4 洗片：取出芯片在42℃洗涤液I中摇床洗涤2 min，取出放入已经预热42℃洗涤液Ⅱ中洗涤2 min后甩干。 1.2.5 结果判定：用晶芯针LuxSeanTM 10K／B微阵列芯片扫描仪对芯片进行扫描，每次试验均设正常对照及空白对照各一份。 2 结果 96例标本中共检出16例携带致聋突变，阳性率为16.67％。其中9例(9.38％) GJB2基因突变，包括2例235 del C纯合