大豆油体与egf融合基因的克隆及其在红花种子中的表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（４）：７１７７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 大豆油体与ＥＧＦ融合基因的克隆及其 在红花种子中的表达 １ ２ １，２ ２ ２ ２ ２ １ 庞实锋 　姜　潮 　李文荣 　冯治国　刘　敏 　楚生辉 　李校 　郑克勤 （１广东医学院基础医学院　东莞　５２３８０８　２温州医科大学药学院　温州　３２５０３５） 摘要　目的：旨在建立一种在红花油体中表达ＥＧＦ的转基因植物的方法。方法：通过 ＰＣＲ技术 把大豆油体基因（ＤＤｏｉｌ）与ＥＧＦ构建成融合基因，克隆至植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３９０Ｒ中，构建 成植物表达载体ｐ１３９０ＤｏＥＧＦ，然后转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４中用于侵染红花外植体，通过甘露糖 筛选培养基培养可获得红花转化苗。通过 ＰＣＲ、实时荧光相对定量 ＲＴＰＣＲ、ＳＤＳＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析目的基因的表达情况，通过ＭＴＴ法检测ＥＧＦ的促细胞增殖活性。结果：ＰＣＲ结 果显示，红花叶片中能检测到 ＥＧＦ基因；实时荧光相对定量 ＲＴＰＣＲ结果显示，在红花种子中 ＥＧＦ能成功实现转录；ＳＤＳＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证明，在转基因红花种子中能有效表达出 ＥＧＦ，并具有其原有的免疫原性，ＭＴＴ法实验结果表明ＥＧＦ具有促进ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞增殖的生物 活性。结论：大豆油体和ＥＧＦ融合基因已经成功转化进红花细胞的基因组中，并实现了ＥＧＦ外 源蛋白在红花种子油体中的表达，为ＥＧＦ蛋白的产业化生产探讨了一种新的生产途径。 关键词　油体　表皮生长因子　转基因红花　融合基因 中图分类号　Ｑ７８６ 　　人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ， 一年生草本植物，是传统的药用植物，含有丰富的油酸 ｈＥＧＦ）是ＣｏｈｅｎＳ于１９６２年研究神经生长因子时发现 和亚麻酸，具有活血通络、祛瘀止痛的功效，在医学上 的。ｈＥＧＦ是一种典型的小分子多肽物质，分子量 应用广泛。这些活性成分除了传统的分离提取外，现 ６．２ｋＤａ，等电点４．２～４．６，具有诱导细胞增殖、分裂分 在已开始对红花进行基因修饰，得到转基因产品，包括 ［１３］ 亚麻酸和油体改造。由于红花油含量丰富，而在植物 化，促进其生长 的功能。许多研究表明，ＥＧＦ具有 γ 明显促进创面愈合并提高皮肤修复质量的作用，可广 中，种子中的蛋白含量较高，因此，这种优势使得许多 泛应用于皮肤烧烫伤、角膜移植、术后创口、溃疡、褥疮 科学研究正在应用种子进行外源基因的表达。２００８ 等的治疗，是一种很有发展前景的临床应用药物与美 年，加拿大ＳｅｍｂｉｏＳｙｓ生物工程公司利用红花油体成功 容因子［４６］。大肠杆菌是很好的人表皮生长因子表达 生产出胰岛素，并在２００９年通过动物药理实验与Ｉ期 ［７］ ［８］ 系统，但是应用大肠杆菌生产的人表皮生长因子，由于 和ＩＩ期临床试验 。Ｎｙｋｉｆｏｒｕｋ等 将载脂蛋白ＡＩ 常会形成包涵体，复性程序复杂，而且由于原核表达系 （ＡｐｏＡＩ）基因导入到红花植物种子中，其载脂蛋白积累 统，没有象真核生物一样的翻译后修饰过程，生产的 量可以达到红花种子总重量的０．００７％。利用红花油 ＥＧＦ活性较低，故此我们尝试利用转基因植物进行 体生产转基因蛋白，只需要简单的种子破碎，通过离心 ＥＧＦ的表达研究。 分离和有机溶剂提取，即可获得相当纯的外源基因产 　　红花（Ｃａｒｔｈ