新兴猪γ干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会养猪学分会论文集 新兴猪丫一干扰素基因克隆及其 真核表达质粒的构建 陈瑞爱裴仉福+唐秀英唐满华温纳相温志芬 (广东大华农动物保健品有限公司，广东新兴527439) 摘要为研发猪t干扰素(interferon．gamma，IFN．1，)制剂，根据NCBIGenBank中已发表的猪ⅢN吖 基因序列设计一对引物，应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500bp的基因片段；将其片 段克隆到pMDl8．T载体，经PCR、酶切及序列测定表明，该基因片段由501个核苷酸组成，共编码166 个氨基酸，与NCBI GenBank中的猪IFN．Y基因序列完全一致。新兴猪IFN-T基因的成功克隆和真核表达 质粒的构建，为进一步研发猪干扰素制剂奠定基础。 关键词猪p干扰素克隆真核表达质粒 IFN-·／能明显抑制病毒、其它微生物和肿瘤，且具有免疫增强作用，作为生物药剂或疫苗免疫增 强剂具有安全、广谱、高效、无毒副作用等特点，主要由激活的T细胞和NK细胞产生，在机体免 疫应答调节中发挥重要作用(曹瑞兵等，2004)。猪刀附．丫全基因为501个碱基，编码含166个氨基 酸，前23个氨基酸为前导序列，成熟蛋白质由143个氨基酸组成(杨玉英和曹殿军，2004；李江凌 等，2003)。 本试验对新兴猪脾淋巴细胞进行了IFN-T基因克隆及真核表达载体的构建，为研发新型抗病毒 制剂和疫苗佐剂，为有效控制危害养猪业的传染病奠定了基础。 1材料与方法 1．1试验动物 3周龄新兴仔猪，由温氏集团良洞猪场提供。 1．2质粒载体和菌种 DH5a受体菌由广东大华 pMDl8．T为TaKaRa公司产品，pcDNA3．1(+)为Promega公司，E．coli 农动物保健品有限公司生物技术研究室保存。 1．3工具酶和生化试剂 限制性核酸内切酶EcoRI、Xba DNA聚合酶、T4DNA连接酶、RNA酶抑制 I和HindlII、Taq 剂、DNAMarker RNA 液购自华美公司；E．Z．N．A．Totalkit核酸抽提试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒、质粒提取试 Bio．tek公司产品。其它试剂均为分析纯试剂。 剂盒为Omega 1．4引物设计与合成 根据NCBI I和 GenBank发表的序列设计上、下游引物Pl和P2。上、下游引物分别含有EcoR Xba I位点(由上海博亚生物技术有限公司合成)，引物序列如下： PI：5-CCCGAATTCCAATGAGTTATACAACTrATr丌-3’ P2：5’-TGCTCTAGATTAITITGATGCTCTCTGGCC-3’ 1．5猪脾淋巴细胞的诱导培养及总RNA的提取 无菌取猪脾脏，120目钢网中磨碎过滤，经淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，稀释成1X107个／mL， 用含500单位，IIlL双抗、5I_tg／rnhPHA和100mI以．小牛血清的RPMll640培养基进行培养，在37℃ r／rain 体积分数为5％CO：和充足湿度的条件下诱导培养，培养24h后，收集淋巴细胞培养物，4℃500 ‘通讯作者：裴仉福，E-mail-peizhangfu2003@yahoo．com．cn。 384 疾病控制 离心5 RNA Bio-tek公司E．Z．N．A．TotalKit使用说明书进行。提取的总RNA溶液直接用于 的提取按Omega RT-PCR或一70。C保存。