SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量.docxVIP

实验 6 SDS电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；掌握垂直板电泳的操作方法；运用SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr = －b·mR+ K（式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b 和K均为常数。）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。实验步骤1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。（夹子离梳子底边约2mm）2. 制备分离胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加乙醇。10－15min后，待分离胶凝固，倒出乙醇。3. 制备浓缩胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶4. 往分离胶层上加浓缩胶，将梳子插入胶液顶部（20min）。5. 样品处理：在1.5ml离心管中按1：1体积比加样品和上样缓冲液，100C加热3min。6. 浓缩胶完全聚合后，将凝胶固定于电泳装置上，内、外槽各加入电极缓冲液，小心移除梳子，注意排出气泡。（注意：取下橡胶框）7. 用移液枪依次在各个样品槽加样（20－40L）。（注意：将marker置于中间泳道）8.电泳：连接正、负极，打开电源，刚开始时，电压控制在120～130v左右，样品进分离胶后，缓慢升高电压至140v。保持电压强度不变。待指示剂染料靠迁移至下沿处停止电泳，需1.5小时左右。9.剥胶染色：电泳结束后，取下凝胶膜，卸下凝胶膜上的橡胶框，用金属片将短玻璃撬开后取出凝胶板。将剥离下来的聚丙烯酰胺凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色约15min。10.脱色：染色完毕，倾出染色液，换2～3次漂洗液，共脱色2小时左右。11.观察：将观察分析结果（分子量、纯度）写在实验报告上。思考题1、用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？2、SDS在该电泳方法中的作用是什么？