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基因技术 Genetic Technologies 第一节 基因工程 Gene engineering 基因工程的基本概念 （一）重组DNA技术 （recombinant DNA technology） 是指在体外按人们的意愿将不同的DNA分子或片段进行剪切和连接的技术。 一、基因工程操作中常用的工具 (一)工具酶（treating enzymes） (二) 载 体（vector） 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同源粘性末端：用同一种限制酶切割的异源DNA片段产生相同的粘性末端 同尾酶：有些限制性内切酶识别序列不同，但酶切后可以产生相同的粘性末端 常用限制性核酸内切酶的特性 2. 其他相关酶类 T４ DNA连接酶用于互补粘性末端和平端DNA分子之间的连接。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 具有5→3的聚合酶活性， 5→3外切酶活性, 3→5的外切酶活性。 逆转录酶或者反转录酶（reverse transcriptase）是以mRNA为模板合成互补DNA即cDNA，用于组建cDNA基因文库。 以RNA为模板合成DNA 5→3合成方向 无外切酶活性 T４多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase)能催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5端羟基上。 用于： 放射性磷标记DNA链的5-末端 使缺少5-端磷酸的DNA磷酸化，用于连接反应 碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除DNA或RNA 5-端的磷酸产生5-端羟基以防止载体的自身连接。 末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）能催化单核苷酸转移到DNA的3 -端的羟基上。 重要的工具酶 基因工程中使用的质粒具备的特点 质粒的复制型 分为松弛型和严谨型两类。 质粒的不相容性 作为载体的质粒一般是不相容的。 质粒的接合性 用作载体的质粒都是非接合性质粒。 多克隆位点 即多种限制性内切酶的单一识别序列。 筛选标记 常用双抗生素抗性插入失活筛选标记和 蓝白菌落筛选标记。 pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS). pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶 3. 粘粒 (cosmid) 4.病毒（virus） 载体必须具备的基本条件 ⒈ 有自身的复制子，能独立复制 ⒉ 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) ⒊ 具有遗传表型或筛选标记 ⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 ⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 ⒍ 载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。 二、基因工程的操作过程 （一）分：目的基因的分离制备 （二）选：载体的选择和制备 （三）接：DNA分子的体外连接 （四）转：将外源DNA导入受体细胞 （五）筛：目的基因的筛选和鉴定 （六）扩：DNA重组体的扩增、表达和其他研究 聚合酶链反应( PCR) （二）选：选择和准备载体 粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 平头末端连接 某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。 定向连接 将目的基因定向插入载体，通常用两个不同的限制酶同时切割目的基因和载体，在目的基因和载体上产生不同的粘性末端，或者一个粘端，一个平端，从而限制目的基因的插入方向。 （四）转：重组DNA导入宿主细胞 转化（transformation） 直接将DNA导入细菌 感受态细胞（competent cell）：用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称