色谱分析（中国药科大学） 第5章 现代色谱技术简介.docVIP

第五章 现代色谱技术简介 第一节 高效毛细管电泳分析法（high performance capillary electrophoresis, HPCE） 概述 发展 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳——第一次的自由溶液电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳分析法。 特点 仪器简单、易自动化 分析速度快、分离效率高 操作方便、消耗少 应用范围极广 高效毛细管电泳理论基础 高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 电泳：带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。 当带电离子以速度在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。 电场力： 阻力： 故： -离子所带的有效电荷；-电场强度；-离子在电场中的迁移速度；-平动摩擦系数 ( 对于球形离子：,-离子的表观液态动力学半径；-介质的粘度)。所以，迁移速度： 淌度（mobility） ：单位电场强度下的平均电泳速度。 淌度不同是电泳分离的基础。 电渗现象与电渗流 电渗流现象 当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。 HPCE中电渗流的大小与方向 电渗流的大小用电渗流速度V电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度。 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极； HPCE中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。 HPCE中电渗流的作用 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性； 电渗流的微小变化影响结果的重现性。 HPCE中影响电渗流的因素 电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。 毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同； 电解质溶液性质的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。 温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 添加剂的影响 加入浓度较大的中性盐（如K2SO4），溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小； 加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向，如加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），电渗流增大； 加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。 HPCE中的参数 迁移时间（保留时间） 分离效率（塔板数） 分离度 影响分离效率的因素——区带展宽 纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽。由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率——大分子生物试样分离的依据。 进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散，分离效率明显下降。 焦耳热与温度梯度的影响 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。 改善方法：减小毛细管内径；控制散热。 溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。 改善方法：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。 其他影响因素 电分散作用及“层流”现象。 高效毛细管电泳的分离模式 毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis ，CZE） 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；V电渗流 V电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic c