生物技术药物中宿主dna残留q-pcr检测法的方法验证.pdfVIP

中国医药生物技术 2016 年2 月第11 卷第1 期 Chin Med Biotechnol, February 2016, Vol. 11, No. 1 69 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.014 ·技术与方法· 生物技术药物中宿主DNA 残留 Q-PCR 检测法的方法验证 * * 刘晓志 ，张斌 ，赵伟，魏敬双，王志明，高健 自 20 世纪 50 年代，用于生产生物技术药物的细胞基 司产品；磁力架为美国 Applied Biosystems 公司产品。 质一直因其安全性而备受关注，生产用基质细胞经历了从原 1.2 方法 代细胞，二倍体细胞到传代细胞的发展历程，人们对其潜在 1.2.1 样品中残留 DNA 提取 采用磁珠分离法对阴性 风险的认识也在不断变化。虽然，至今没有因为生物制品中 对照品、质控样品、待测样品进行核酸提取。依照试剂盒说 DNA 残留量而引发不良反应或安全事故，但其用量随着临 明书操作，取 100 μl 样品溶液于 1.5 ml 离心管中，加入 床治疗的需求越来越大，需要长期反复用药的生物制品也越 10 μl 的 5 mol/L NaCl 、10 μl 的蛋白酶 K 、60 μl 的蛋白酶 来越多，同时，疫苗的使用者为健康人群，这些都使得药品 K 缓冲液，混匀，56 ℃ 水浴 30 min ；加入 360 μl 的裂解 监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中 DNA 残 液，再加入 30 μl 经 37 ℃ 预处理的磁珠和 400 μl 结合 留量的质量控制一直是人们关注的热点。几十年来对于残余 液，漩涡振荡 5 min ，充分混匀后，离心 15 s ，磁力架放置 DNA 问题的争论一直在继续，有的观点认为应将残余 5 min；加入 300 μl 的清洗缓冲液，漩涡振荡 5 s ，离心 15 s ， DNA 作为一种重要危险因素[1] ，也有人倾向于将残余 DNA 磁力架放置 1 min ，小心吸掉上清，重复两次；打开管盖， 作为一般杂质控制。各国研究机构围绕着残余 DNA 问题 室温放置 5 min ，挥发管壁残留液体；加入 50 μl 的洗脱液， 都做了大量的工作，国内外也有很多有关细胞基质及残余 漩涡振荡器振荡 10 s ，然后将其放入 70 ℃ 水浴 7 min ， DNA 的文献和技术指南发表[2-4] 。但根据现有研究结果，现 期间漩涡振荡 3 次；离心 15 s ，磁力架放置 2 min ，转移 在认为应将其视为一般杂质，并控制其在生物制品中的含量 上清于 1.5 ml 离心管中，最大转速离心 3 min ，磁力架放 达到纯化工艺可控制的最低量。 置 1 min ；转移上清于 1.5 ml 离心管中，备用。 残余 DNA 的分析检测也经历了一系列变革，很多方 1.2.2 Q-PCR 检测 采用 Taqman Q-PCR 法对样品