影响异种克隆牦牛囊胚发育的研讨.pdfVIP

2004学术年会 由表中可知，AC基因型与其他基因型相比有较低的肌内脂肪含量且差异显著：BB基因型与 其它基因型相比有较低的皮下脂肪厚且差异显著；对于腹脂率和肌间脂宽的比较，则未发现几种基 因型之间有显著差异。 3讨论 第一个突变位点和第三个突变位点位于密码子第三位，不导致氨基酸的变化。AA型编码丙氨 酸，BB型编码苏氨酸，是有义突变。但是这样的氨基酸改变是否影响蛋白质功能以及如何影响蛋 白质功能还需进一步研究证明。 根据SAS统计分析的结果可以得出BB型纯合子有较低的皮下脂肪厚且差异显著(p0．05)， 但是BB型的个体只有9只，差异显著可能是由于样本数少造成的，因此有必要增加群体数量对这 一位点的基因型效应进行验证。 影响异种克隆牦牛囊胚发育的研究 李彦欣Iv戴蕴平1，杜卫华1，赵春江1，王莉莉1，王海平2刘颖2李荣2，李宁+ 1．中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100094 2．北京基因达科技有限公司，北京100082 摘要：异种克隆是保护濒临灭绝物种一种行之有效的方法，但该方法始终受到效率低下的困扰。 本研究体外培养了不同个体的牦牛耳成纤维细胞、颗粒细胞和输卵管细胞，分别作为供核细胞移入 去核牛卵母细胞中，均可完成体外牦牛的早期囊胚发育(囊胚率高达35％)。通过对不同年龄阶段、 不同个体、不同细胞类型、细胞的饥饿与否、细胞冷冻与否，以及卵母细胞成熟率，不同融合到激 活时间对克隆效率的比较发现：卵母细胞的质量是核移植成功的基础，当成熟率在40％以下时，将 显著影响异种克隆牦牛的囊胚发育(由25％降到3％，PO．01)；发现影响异种克隆牦牛早期囊胚发 育的重要因素为延迟激活时间，当延迟激活1．5小时可显著提高异种克隆囊胚率(由21％提高到 35％，P0．05)；而不同类型细胞、不同个体、不同年龄、饥饿与否、冷冻与否对异种克隆牦牛早期 囊胚发育影响不显著，这为简化供体细胞的处理提供了依据。异种克隆囊胚核基因组和线粒体遗传 物质鉴定结果表明：囊胚核基因组来自牦牛供核细胞，囊胚线粒体以牛卵线粒体为主，牦牛供体细 胞线粒体含量甚微。 关键词：牦牛异种克隆体细胞囊胚发育囊胚鉴定 由于掠夺性捕猎，生态环境的破坏，使地球上物种迅速减少。统计数字表明，几乎平均每小时 就有～个物种灭绝。1997年，绵羊Dolly的诞生，为快速有效的保护这些珍稀物种提供了一种全 新的方法。在1999年，Daminko证明牛卵可使绵羊、猪、猴、大鼠体细胞核重编程并完成体外早 期囊胚发育(大鼠除外)。此后，利用异种体细胞核移植技术先后在大熊猫、野牛、水牛、盘羊等 获得早期囊胚发育，有的可妊娠一段时间，甚至健康出生(仅有盘羊)。但总的说来，异种克隆效 率均较同种内克隆低，而体细胞核在卵胞质中重编程的基本机制仍然不被人知。为了探讨通过克隆 技术保护国家一级保护动物牦牛的可能性，本研究采取牦牛的耳、输卵管、颗粒细胞作为供核移入 去核的牛卵中，进行异种克隆的尝试。分别对牦牛不同年龄、不同个体，不同细胞类型，细胞饥饿 与否、细胞冷冻与否、不同成熟率的牛卵细胞，以及不同延迟激活时间等各种可能影响异种克隆效 率的因素进行比较，试图寻找制约异种克隆的关键因素，从而更有效的提高异种克隆效率，使该项 bta neton) 通讯作者(ninglbau@public3 2004学术年会 技术在保护濒危物种方面提供一个可行的方法。 1材料与方法 1．1 供体细胞的培养． 分别取2个3月龄白牦牛A、B和1个4岁的黑牦牛1的耳和1个4年的黑牦牛2的输卵管组 织，无菌分离牦牛耳的皮肤层和输卵管的粘膜层，剪碎，用PBS液冲洗三遍。将组织块均匀铺在 培养瓶底，倒置于37。C，5％C02培养箱中静置4—6h。待组织块贴牢后，加入适量DMEM／Fl2(GiBco) 吸取直径为2-8mm的卵泡，收集含卵丘卵母细胞复合体的卵泡液，离心，弃上清。用o．1％的透明 脂酸酶(GiBco)消化3min，离心，弃上清。将沉淀轻轻吹打3min，再以DMEM 5％C02培养箱中。细胞传至2-8代时，用于克隆实验。 1．2供体细胞的冷冻． 当细胞传到4—15(颗粒细胞2-8代)代时，先用0 存于一70℃。 1．3供体细胞的饥饿． 常规培养细胞生长至融合