引物设计与序列分析.ppt

See you later ! * 引物设计与序列分析 primer design and sequence analysis 2015-9-24 引物设计要领 一般为15-30 bp，常用18-25 bp，最长不应超过38 bp 。 引物过短会引起错配现象，一般引物长度应大于16bp。 引物的长度 引物设计要领 引物的碱基分布 ——同一碱基连续出现不应超过5个； ——GC含量一般40-60%； ——GC含量太低会导致引物Tm值降低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性； ——GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物设计要领 引物的Tm值 ——Tm值一般要求为55℃-65℃。 ——两个引物的Tm值相差不能大于5 ℃。 ——扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性。 引物设计要领 引物的二级结构 引物二聚体：尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补。 发夹结构：尤其是要避免引物3’端形成发夹结构。 引物设计要领 引物的3`端 ——引物的延伸从3`端开始，因此3`应与模板DNA严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致扩增失败。 ——引物3`端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会增加错误扩增的机率。 ——3`端末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，应当避免在引物的3’端使用碱基A。 引物设计要领 引物的5`端 5’端可以引入与模板DNA不配对碱基。 ——5’端加上酶切位点和适当数量的保护碱基； ——5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究； ——5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 引物设计流程 序列查找 序列保存 引物筛选 保守区选择 *