实时荧光定量PCR在检测流感病毒中的应用.docVIP

精品论文 参考文献 实时荧光定量PCR在检测流感病毒中的应用 龚靖丹 　　义乌国际旅行卫生保健中心 322000 　　摘要：目的：探讨荧光定量PCR的检测流感病毒中的应用。方法：采用实时荧光定量PCR法对60份经胶体金快速检测法筛查检测的标本进行检测，进行统计分析，评估不同方法灵敏度和特异性差异。结果：实时荧光定量PCR法和胶体金快速检测法的阳性率分别为78.33%和58.33%，胶体金快速检测法较于实时荧光定量PCR的灵敏度和特异性分别为74.47%和53.85%。结论：实时荧光定量PCR检测技术可作为流感防控的病原快速检测技术。 　　关键词：流感病毒；胶体金快速检测；实时荧光RT-PCR 　　流行性感冒病毒（Influenza virus）是正黏病毒科的代表种，简称流感病毒，是单负链分节段的RNA病毒，易引起人群的上呼吸道感染。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原体。病毒的表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）易发生变异，是导致其引起世界大流行的原因。甲型流感病毒可感染多种动物，也是人类感染的主要病原。甲型流感病毒根据其H和N抗原的不同，又可分为多个亚型。其中H抗原有15个亚型，N抗原有8个亚型。人类容易感染和传播的主要有H1N1、H2N2、H3N2这三种亚型。 　　流感病毒的临床症状容易和普通感冒相混淆，传统的实验室确诊方法耗时长而且技术要求高，无法及时对暴发疫情做出诊断。实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技术，利用PCR对核酸的高度扩增，探针技术的高特异性的特点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，不仅克服了常规PCR检测易污染与假阳性率高的缺点，而且具有特异性强、灵敏度高和自动化操作等优点，利用RT-PCR方法可快速检测流感病毒。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本 采集自义乌机场出入境发热旅客60例。 　　1.2设备与试剂 荧光定量PCR仪ABI7500，全自动核酸提取仪ABI magMAX，生物安全柜上海力康，高速冷冻离心机为德国Sigma RT-PCR试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，RNA提取试剂盒为ABI公司生产，流感胶体金快速检测试剂由浙江省出入境检验检疫局提供。 　　1.3 病毒RNA的提取 按照试剂盒说明书将每个反应按3mu;lCarrierRNA和232mu;lLysis/Binding Solution Concentrate比例制成混合液，加入到Bead管，再加175mu;l样本，振荡击打Bead 15分钟后，16000times;g离心3分钟，将Beads聚集在一起。将前处理过的样本和试剂加入8联管中，A孔加入100%异丙醇65mu;l磁珠混合液20mu;l样本裂解物115mu;l，B孔加入洗液Ⅰ 150mu;l，C孔加入洗液Ⅰ 150mu;l，D孔加入洗液Ⅱ 150mu;l，E孔加入洗液Ⅱ150mu;l，F孔加入洗脱液90mu;l，将反应管放入全自动核酸提取仪中进行核酸提取。 　　1.4 试剂的配制 取ntimes;8mu;lIFVAamp;IFVB核酸荧光PCR混合液，ntimes;1mu;l内部对照品，与ntimes;1mu;lR-PCR酶（n为反应管数），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。 取上述混合液20mu;l置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5mu;l分别加入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增。 　　1.5病毒的扩增 反应管至于定量荧光PCR仪上，按照试剂盒推荐循环参数设置：45℃times;10min；95℃times;15min；再按95℃times;15secrarr;60℃times;60sec，循环45次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25mu;l。荧光通道检测选择：选用FAM、HEX（或VIC/JOE）和ROX通道。 　　1.6胶体金快速检测法按照试剂盒说明操作。 　　2 结果 　　在60份样品中，实时荧光PCR法检测出阳性样本47份，其中35份经胶体金快速检测法检测为流感阳性，同时在13份实时荧光PCR法检测为阴性样本中检出7份流感阳性样本，两者符合率为70%[（35+7/60）]，胶体金快速检测法检测灵敏度是实时荧光PCR法的74.47%（35/47），胶体金快速检测法特异性为实时荧光PCR的53.85%（7/13）。经统计学检验，P＜0.005，表明两者差异显著，具有统计学意义。 　　2.1特异性 　　只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5-3prime;端的外切酶活性，讲探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题。双重荧光PCR方法对甲型流感的