临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用.pptVIP

基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用;;中心法则;基因重组技术 基因探针技术;基因诊断;基因诊断的特点;聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction（PCR）;;PCR技术的应用;;; PCR原理示意图;;;;;;影响PCR效果的重要因素及注意事项：;;;;荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较;HLA分型技术;HLA分型技术;HLA分型技术;;三、主要方法： 1、HLA血清学分型。 2、常规PCR-SSP反应。 3、SBT分型法： (1)PCR扩增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自动测序仪测序。 (3)测序数据分析及分型。; 结果和讨论;;;4、荧光定量PCR技术原理： ;图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比;图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果;图5、SSP分型结果与上述一致;FQ-PCR分型的优点： (1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。 (2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCR后处理的时间，结果更客观。 (3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。;(4)只需在反应前打开离心管一次，即可完成所有的操作，减少了污染的机会，进一步提高了特异性和灵敏性。 (5)本FQ-PCR HLA DRB1配型较常规FQ-PCR减少了合成的荧光探针数量。 (6)可得出起始模板拷贝数定量结果。;基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用;基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用; 血友病甲基因诊断;甲型血友病Ⅷ因子基因倒位的研究及检测新技术：;;自行设计合成了长距离PCR的四个引物P、Q、A、B。预期扩增产物长度P/Q为12Kb，A/B为10Kb，P/B及A/Q为11Kb。; 四引物及三引物LD-PCR体系的比较; 系统优化了引物浓度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO浓度，基因组DNA的质量和用量，退火及延伸温度、时间，低浓度琼脂糖凝胶电泳条件及操作方法等。使10-12Kb DNA扩增及检测倒位终获成功。这充分体现了该成果的科学性和先进性;不同量模板DNA对LD-PCR 的影响1--5号的DNA量分别为0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μg;不同量deaza-dNTP对LD-PCR的影响1--5号dNTP浓度分别为200，300，400，500，600μM; 53份重型HA患者及家系成员DNA标本，分别用经典的Southern印迹杂交和本LD-PCR技术在双盲条件下进行FⅧ基因倒位检测。两者得出的诊断结论完全一致。表明用LD-PCR技术诊断该基因倒位，检出携带者的特异性和灵敏度均达到百分之百。而且具有操作步骤较简便，需DNA量少，出结果快，不需操作放射性同位素标记探针，在无法取得先症者患儿血样的情况下，也可直接查携带者是否携带倒位基因，如果是可直接做产前诊断等优点。;双盲实验（53份DNA）结果证明：LD-PCR可独立用于重型HA基因倒位的检测;应用实验成功的LD-PCR技术，对来自北京、天津、江苏、湖北、广西、四川、山东、福建等省市的108 个重型HA患者及数目不等的家系成员进行了检测，共查出FⅧ基因倒位47例，占44%，与国际上用Southern杂交技术查出的基因倒位引起的HA约占重型HA的40-50%一致。另外，检出30余位倒位基因携带者，为将来开展产前基因诊断，杜绝新的HA患儿出生打下了基础，对优生、提高人口素质有重要意义。;;14个DNA标本LD-PCR电泳结果M：λDNA/HindⅢ酶解产物，三条带分别为23.1kb，9.4kb，6.6kb;;美国Steve.S.Sommer去年与我们同期发表了一篇类似技术方法的摘要文章。但我们较他们有两个显著不同特点：一是我们强调了运用P、Q和B这三个引物就完全可以满足诊断的需要，省去一个引物A，减少一条10Kb扩增带。这条10Kb带是多余的，且使11Kb及12Kb带出现的难度增大。二是我们研究成功方法后，立即迅速应用于患者及其家系的诊断和携带者检出，现已达一百余家系，产生了很大社会效益和一定的经济效益，并开始向兄弟单位推广应用。; HA8家系 PCR/BclⅠ酶解分析结果M: pBR322/MspⅠ；0:Ⅱ-2（酶解前）扩增带长374bp，图中211bp和163bp为酶解后产物 M Ⅱ3 Ⅰ1 Ⅰ2 Ⅱ1 Ⅱ2 0 ; HA15家系 St14位点VNTR多