单活性结构域T7核酸酶玉的制备及性质研究-生物化学与生物物理进展.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2010, 37(4): 426~432 单活性结构域 核酸酶 的制备及性质研究* T7 1, 2) 1) 1) 3)** 1, 2)** 三红 单丽伟 王保莉 管楚 郭蔼光 1) 2) ( 北农林科技大学生命科学学院，杨凌7 12 100 ； 北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌7 12100 ； 3) New England Biolabs Inc., Ip swich 01938, MA USA) 摘要 T7 核酸酶 (T7E )是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction (HJ) 的多功能核酸酶，该酶不仅能特异识 别和拆分HJ，而且能随机切刻双链DNA ，特异识别并切割双链DNA 中的切刻和单碱基错配位点 构建了两种原核表达载 体用于表达MBP 和His-tag 融合的两种T7E 突变体，MBP-T7E (E20K)和His6-T7E (E65K) 每一种融合蛋白形成的同 源二聚体不具有核酸酶活性，通过共表达或两种蛋白 共变性复性、双标签亲和纯化，最终获得具有单个活性结构域的 T7E 异源二聚体(T7E -SAD) 以pUC(AT)和pUC19 为底物测试T7E -SAD 的HJ 拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切 割活性，结果显示，T7E -SAD 可特异识别并切刻HJ 结构，但丧失了同时引入两个切刻位点的能力，其对pUC(AT) 的特异 切刻活力和对pUC 19 的随机切刻活力与野生酶相当 逐级变性梯度洗脱实验显示，T7E -SAD 的稳定性与野生型酶接近， 二聚体解离需要5.0～6.0 mol/L 尿素或1.75～2.0 mol/L 盐酸胍；凝胶阻滞实验表明T7E -SAD 具备与HJ 结构特异结合的能 力 为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略，同时提供了一种简便直观的蛋白 二聚体稳定性测试方法 关键词 T7 核酸酶 ，结构域交换，单活性结构域，二聚体稳定性，催化特性 学科分类号 Q55 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00580 遗传重组是进化最主要的驱动力之一，生物通 T7E 对HJ 的结合具有高度特异性，其结合HJ 的 过遗传重组引入或删除遗传信息、维持遗传信息的 能力是结合线性双链DNA 的1 000 倍左右[3] 如 相对稳定 重组中间体Holliday Junction (HJ) 的拆 图1 所示，T7E 除了具有专一性的HJ 结构拆分 分是DNA 重组的关键步骤，参与这一过程的酶称 活性外，还具备随机在双链DNA 中引入切刻位点 为解离酶(resolvase) 解离酶广泛存于病毒、原核 的活性，专一性识别切刻位点并在另一条DNA 链 生物和真核生物，已发现的解离酶均以二聚体形式 上对应位置引入另一切刻位点导致DNA 双链的断 存在，它们能特异识别重组中间体HJ ，并在分枝 裂，专一性识别并切割DNA 双链中的单碱基错配 点附近同时引入两个切刻位点，将四链交叉结构拆 位点[5-6] 一定幅度内改变 -bridge 的长度和氨基酸 茁 分成两条带有切刻位点的双链DNA[1] 组成后T7E