基因组研究技术与平台.ppt

Roland Berger Strategy Consultants Module und Variations_E 1. 核酸的提取与纯化 材料选择: 　丰度高、容易提取的组织（组织、全血、血清、质粒） 提取过程: 　 破细胞 去杂质 浓缩 纯化 选择方法 酚抽提法 (注:当酚被氧化成醌，显红色, 会使核酸降解) 膜过滤法（对抗冷冻的全血） 磁珠提取法（不用离心、酚／氯仿 、乙醇) 核酸纯化 (1) PCR扩增产物 电泳 胶回收 (去除非特异性扩增产物、 dNTPS ，引物 Taq酶） (2) DNA载体及重组子（大于20kb) 　 易污染宿主染色体断裂成的大分子DNA片段 用切割线状及开环的DNA,对闭合的DNA无作用的 Plasmid safe ATP- dependent DNAase (3) 基因治疗与疫苗的核酸 (超纯) 　 亲和层析，去除热源(内毒素) 2. 酶切反应与电泳技术 限制性内切酶酶切反应 （ Restriction Endonucleases） 酶量: 1μg:1U/1h 通常用量　：5倍 甘油浓度：不超过5% (以上两项过高，易出现星号活性） 　 双酶切反应： (1)双酶切缓冲液 (2)先低盐,后高盐 3. 基因重组与表达技术 重组子鉴定 基因表达 选择表达系统 原核系统 真核酵母 动物细胞 植物细胞 How to know the role of the gene of interest plays in the life activities furtherly ? 3. PCR与荧光定量PCR技术 PCR原理与过程 the PCR consists of three defined sets of temperatures and times termed steps: (1) denaturing, (2) annealing, (3) extension. Denaturing 94℃ 45 Sec Annealing 50-63℃ 30 Sec n cycles Extension 72 ℃ 45 Sec Annealing temperature: Ta=Tm-5 ?C Extension time: 1kb/1min PCR相关技术 一. 锚定PCR 二. 不对称PCR 三. 反向PCR 四. 多重PCR 五. 原位PCR 六. 差别PCR 七. 逆转录PCR(RT-PCR) 八. 荧光定量PCR 　　荧光定量PCR技术 标准品制备 荧光定量PCR设计流程 1.遗传性疾病的基因诊断 2.传染病的诊断(肝炎病毒) 3.法医学(亲子鉴定)上的应用 4.DNA测序 5.基因克隆 6.引入基因点突变,基因融合 7.肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断 8.原癌基因的mRNA进行定量分析 4. 核酸杂交与基因芯片技术 (1). Transfer blotting (转移印迹) Southern blotting DNA /DNA 　　　　　　　　　（Dr. Edwin Southern in Edinburgh University in 1975） Northern blotting DNA /RNA (2). Dot blotting Slot blotting (点印迹, 狭缝印迹) (3). In situ hybridization (原位杂交) (4). DNA Chip(基因芯片) :high through-out (2) Dot/Slot blotting (点印迹/狭缝印迹) (3). In situ hybridization(原位杂交) 　 nucleic aci