siRNA 对人食管癌EC9706 细胞蛋白激酶CK2β 基因表达的影响.docVIP

精品论文 参考文献 siRNA 对人食管癌EC9706 细胞蛋白激酶CK2β 基因表达的影响 周强1 宋晓春2 龙安予1 滑洋洋1 吴晓东1（ 1 郑州市儿童医院病理科 河南郑州 4 5 0 0 5 2 ； 2 南阳市中心医院病理科 河南南阳 4 7 3 0 0 0 ） 　　【摘要】目的：探讨小分子干扰RNA（siRNA）对人食管癌EC9706 细胞蛋白激酶CK2beta; 基因表达的影响。方法：体外转录合成CK2beta; siRNA，转染EC9706 细胞，采用RT-PCR 及免疫细胞化学技术检测转染前后CK2beta; 的表达水平。结果：各实验组CK2beta; 表达量均较对照组降低（plt;0.05）。结论：特异性siRNA 能有效抑制EC9706 细胞中CK2beta; 基因的表达。 　　【关键词】 蛋白激酶CK2beta; 食管癌 EC9706 细胞 siRNA【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）36-0073-01蛋白激酶C K2 是真核生物细胞中第二信使非依赖性丝/ 苏氨酸蛋白激酶，由两个alpha; 亚基和两个beta; 亚基形成的四聚体，在细胞的生长增殖、凋亡中发挥着重要作用[1-2]。现有研究显示C K2beta; 基因在人体多种恶性肿瘤中表达水平明显升高[3-5]。本实验通过构建C K2beta; 的特异性siRNA，转染人食管癌EC9706 细胞，观察CK2beta; 对肿瘤细胞生物学特性的影响，为进一步研究C K2beta; 在食管癌发生发展中的机制提供科学的理论依据。 　　1 材料与方法1.1 材料 人食管癌EC9706 细胞株（中国医学科学院馈赠）；T7 RiboMAX Express RNAi System 购自美国Promega 公司；Trizol 试剂、RT 试剂盒购自美国Invitrogen 公司，鼠抗人CK2beta; 单克隆抗体购自基因公司。 　　1.2 方法1.2.1 siRNA 的合成 根据Gene Bank 中参考序列设计siRNA模板，按T7 RiboMAX Express RNAi System 说明书操作，得到双链siRNA，无关模板按如上操作得到无关siRNA。 　　1.2.2 细胞培养 将人食管癌EC9706 细胞置于含10 ﹪胎牛血清的培养液中贴壁培养，使细胞在转染时达90 ﹪覆盖率。 　　1.2.3 siRNA 的转染 设24h、48h、72h 三个转染时间，每个时间设150ng/mu;l、200 ng/mu;l、250 ng/mu;l 三个浓度的转染组、正常对照组、无关对照组。收集细胞后滴于载玻片上固定备用。 　　1.2.4 RT-PCR: Trizol 提取各组细胞RNA，逆转录cDNA 后进行RT-PCR。取扩增产物电泳后，经BandScan 进行图像分析，评价mRNA 的表达水平。 　　1.2.5 C K2beta; 蛋白检测：采用免疫细胞化学法，以P B S 代替一抗做阴性对照，光镜下以染色强弱进行评分并进行统计学处理。 　　1.3 统计学处理 用SPSS 12.0 进行统计分析，以alpha;=0.05 为显著性水准。 　　2 结果2.1 EC9706 细胞中CK2beta;mRNA 的表达RT-PCR 结果表明，CK2beta; mRNA 在对照组呈高表达；在转染组呈低表达，且随转染剂量增加siRNA 抑制效应增强，三者相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表1。 　　表1 siRNA 对CK2beta;mRNA 表达的影响（x-plusmn;s） 　　注：各实验组与对照组相比, 均P ＜ 0.052.2 EC9706 细胞中CK2beta; 蛋白的表达 CK2beta; 蛋白定位于细胞浆内，呈棕黄色颗粒。随转染剂量增加siRNA 抑制效应增强，三者相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表2。 　　表2 siRNA 对CK2beta; 蛋白表达的影响（x-plusmn;s） 　　注：各实验组与对照组相比，均P ＜ 0.053 讨论C K2 是由两个催化亚基alpha; 和两个调节亚基beta; 构成的四聚体。Li n等[3] 发现C K2beta; 在胃癌中的表达明显高于其周围正常组织。另有研究发现C K2beta; 在大肠癌中的表达明显升高[6]。在子宫内膜癌中，C K2beta;的表达明显高于正常子宫内膜组织[2]。食管鳞状细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，有关CK2beta; 在食管癌组织中高表达的研究已有报道。 　　本实验采用体外转录法合成CK2beta; 特异性siRNA 并转染EC9706细胞，通过免疫细胞化学、R T - P C R 技术检测C K2beta;