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微生物学实验部分：基本实验 实验一 细菌形态结构的观察 目的 掌握细菌的基本形态与特殊结构 材料 葡萄球菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌革兰氏染色标本片，显微镜，镜油，擦镜纸。观察项目 观察细菌的基本形态 用油镜观察上述标本片，认识细菌的三种基本形态。观察前要明确标本片的涂片材料和染色方法。观察时注意细菌的形状、大小、排列及染色反应，同时绘图。 二、观察细菌的特殊结构： (一)荚膜：肺炎球菌用改良的赫斯(HiSS)氏荚膜染色法染色(见实验十五肺炎球 菌)注意观察菌体与荚膜的形态及颜色。 ， (二)鞭毛：具有周鞭毛的伤寒杆菌用鞭毛染色法染色(见实验二附录)。注意观察菌体与鞭毛的颜色，鞭毛的数量与在菌体上的位置。 (三)芽胞：破伤风杆菌用芽胞染色法染色(见实验二附录)。注意观察菌体与芽胞的形状、颜色及芽胞的位置。 三、观察细菌的运动： 许多杆菌和螺形菌具有鞭毛，能运动，在液体中能定向地从一处泳动至另一处；无鞭毛的细菌无动力，但受到所处环境中液体分子的冲击而呈左右前后位置变更不大的颤动，为布朗氏运动，纯属分子运动。 目的 了解细菌动力检查法及其意义。 材料 绿脓杆菌及葡萄球菌幼龄培养物 方法(压滴法) 显微镜，载玻片，盖玻片，镊子。 一、用接种环分别取绿脓杆菌及葡萄球菌10—18小时肉汤培养物2—3环，放于载玻片上。 二、用镊子夹住盖玻片覆盖于菌液上。覆盖时，先使盖玻片一边接触菌液，缓缓放下，防止出现气泡及菌液外溢现象。 三、显微镜直立，勿使载物台倾斜，将光线调弱，先用低倍镜找到标本，再以高倍镜观察，比较真正运动与分子运动有何不同。 思考题 1、细菌动力检查有何实际意义? 2、细菌的特殊结构有哪些?各有何医学意义 （马廉兰） 实验二 细菌涂片标本的制作及革兰氏染色 目的 掌握细菌涂片标本的制作及革兰氏染色法 原理 革兰氏染色法是常用的细菌鉴别染色法。细菌染色后，不仅可以观察其形态，而且可根据染色结果将细菌分为两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这样有助于对细菌的鉴别，同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供依据。 革兰氏染色的机理，主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌细胞壁中含有较多类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的通秀性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞脱色，经复染后，染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色后，肽聚糖层的孔径变小，通秀性降低，细胞仍保留结晶紫的颜色。革兰氏阳性菌等电点(pm-3)比革兰氏阴性菌。(pH4-5)低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷的碱性染料结合牢固，不易脱色。 材料 1．葡萄球菌和大肠杆菌18—24小时培养后的混合菌液： 2．革兰氏染色液。 3．其他材料同单染色法。 涂片标本的制作 方法 1．涂片 取清洁无油脂的载玻片一张平置桌上，用蜡笔划两个直径约1．5厘米的圆圈，用灭菌后的接种环，在每个圆圈内各加1—2环生理盐水，将接种环在火焰上烧灼灭菌后，从葡萄球菌斜面物上挑取少许细菌放在盐水中，轻轻涂抹，使细菌与盐水混匀涂成直径约1厘米的均匀薄膜，再将接种环灭菌后，从大肠杆菌斜面培养物上挑取少许细菌，在另一侧盐水涂成均匀薄膜。随即将接种环在火焰上烧灼灭菌后才能放回架上。 。 若用液体培养物涂片时，可不必先加盐水。用接种环直接取材料涂成薄膜即可，接种环使用前后的灭菌方法和要求同上。 2．干燥 涂片最好是在温室中自干，必要时可将涂膜面向上，断续地在弱火处烘干，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检视。 3．固定 涂片干燥后，手持玻片的一端，涂膜面向上，在酒精灯火焰上快速地来回通过三次，共约2—3秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍受为度。固定完毕，放置待冷后再进行染色。固定的目的是使细菌的细胞质凝固，杀死细菌，使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉，以及使细菌蛋白质变性改变菌体对染料的通透性易被着色。 革兰氏染色法 方法 1．初染 在已固定的涂片上滴加结晶紫染液，以全面