抗癌药物敏感实验.ppt

* * 抗癌药物敏感实验 一.实验药物储备液的配制 一般按试验最高浓度的100倍配制储备液。 体外药物敏感性试验所用药物浓度，一般根据血浆高峰浓度的0.10，1，10倍的剂量进行。亦可参考以下公式： 试验药物浓度（ug/ml）＝ 试验时，一般3-5个对数级浓度 × 平均体重 60 mg×平均体表面积 100 二.受试细胞的准备 根据实验目的选用体外培养的肿瘤细胞系如国际通用的Hela细胞系等，也可用肿瘤患者的新鲜手术标本制成细胞悬液备用。 三.药物疗效的评价 1.体外抑瘤试验：合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC50＜10ug/ml或植物粗提物的IC50＜20ug/ml，并且有细胞毒性的剂量依赖关系，其最高抑制效应达80％以上；发酵液IC50大于1：100，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。 2.体内抑瘤试验： 实体瘤疗效以瘤重抑制百分率表示，即 瘤重抑制率＝（1-试验组瘤重/对照组瘤重） ×100％ 中草药抑制率＞30％，合成药＞40％ 腹水型肿瘤疗效可以生命延长率表示，即 生命延长率＝（试验组存活天数/对照组存活天数-1） ×100％ 非腹腔给药生命延长率＞50％，腹腔给药生命延长率＞75％ 四.药物敏感性实验 1.体外药物敏感试验 美蓝法：利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，是美蓝还原为甲烯白（无色）。细胞死亡后脱氢酶失活无法使美蓝还原，故染成蓝色。检验用药后死细胞数反映药物抑瘤作用。假阳性率较高。 2.染料排斥实验法： 根据活细胞在低浓度染液不着色特点，一般用0.2％台盼蓝或0.1％伊红试验。药物导致细胞死亡时，细胞膜通透性增加，染料易透过细胞膜。加药后计算阳性细胞数以示药效。由于濒临死亡的细胞不易着色，故假阴性较高。 3.生长曲线测定法 1）药物对细胞的杀伤率 将对照组及加药组生长曲线的线性部分延伸至Y轴，可分别得到截距NO及NO’。代表接种后具有增殖力的细胞数。 药物对增殖细胞的杀伤率＝ [（ NO－ NO’）/ NO]×100％ 2）药物对倍增时间（TD)的影响 TD = t ㏒2 ㏒Nt－ ㏒N0 t代表培养时间， N0 和Nt分别代表接种后及培养1小时后的细胞数。 如倍增时间延长则表明药物使细胞增殖能力减弱。 3）药物对细胞生长饱和密度（Ns）的影响 取出在生长稳定期的培养细胞，计数单位面积或体积的细胞均数，即细胞生长饱和密度。该值减小也表示细胞增殖活性减弱。 4）放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法 常用3H-TDR或3H-UDR掺入DNA或RNA合成期的细胞，用液体闪烁计数仪测知标记的DNA或RNA的含量，从而了解药物对肿瘤细胞DNA或RNA合成的抑制效应。 5）四唑盐（MTT）比色法 Mosmann（1983）首先报道此法。简便快速，便于大规模进行药敏试验，误差小且精确，无放射性污染。广泛应用于临床。 接种细胞 培养细胞 3-5天后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，孵育4h终止培养吸弃上清 每孔加150ulDMSO振荡10min 比色：选择490nm波长酶联免疫检测仪测定光吸收值并绘制吸收曲线 6）三磷酸腺苷生物发光法（ATP－bioluminesence assay） 是一种敏感可靠能测定各种细胞活力的方法。 7）集落形成试验法 8）3H亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法 9）抗癌药物的效能比测定法 2.体内抗癌药物敏感试验 1）裸鼠移植瘤试验 1973年丹麦的C.W.Friis在BALB/cA近交系小鼠中发现自发性突变的无毛小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免疫T细胞缺失，而培育成了BALB/cA-nu。之后引至日本实验动物中央研究所，1989年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。 裸鼠特点: 先天性胸腺缺损 胸腺依赖性免疫功能缺乏，T细胞功能接近于零，但B细胞功能基本正常 异种移植时无排斥反应 故可以进行人体 肿瘤异种移植。 2）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验 1978年Bogden首先报道了将人肿瘤组织移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。 细胞的克隆化技术 *