小檗碱增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 小檗碱增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的实验研究 罗芳 (武汉市普仁医院妇产科 430081) 【中图分类号】R737.31 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）07-0106-02 【摘要】 目的 探讨小檗碱对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。方法 MTT方法检测细胞抑制率。流式细胞术检测细胞凋亡率。Western blot检测PDCD4蛋白表达。结果 小檗碱增强顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制，增强顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡，提高PDCD4在SKOV3细胞的表达。结论 小蘖碱能增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，有可能成为一种新的卵巢癌治疗药物。 卵巢癌是严重威胁女性生命健康的最常见恶性肿瘤之一。据统计，在生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率居第三位，并且有逐年上升趋势, 其5年生存率低于45%[1]。目前, 肿瘤细胞减灭术后联合多疗程化学药物治疗是卵巢癌的基本治疗原则。因此，化学药物治疗在卵巢癌治疗??占相当重要的地位。治疗过程中肿瘤细胞常常对化疗药物产生耐药性，使化疗药物的疗效丧失，从而导致化疗失败和肿瘤复发。本研究拟通过体外实验观察小檗碱对顺铂耐药人卵巢癌药物敏感性的影响，并且探讨其中可能的机制，以期利于含小檗碱中药的现代化开发，及为卵巢癌耐药的防治提供新的思路和实验依据。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV-3购自中国科学院上海细胞生物所。培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100 U/ml链霉素RPMI 1640培养液中，置于5%CO2，37℃培养箱中培养。取对数生长期细胞进行指标检测。 1.2 细胞体外生长活性检测 采用MTT(四甲基偶氮唑蓝,美国Sigma公司)方法检测顺铂单独作用和顺铂联合小蘖碱(美国Sigma公司)作用SKOV-3细胞72h后的吸光度(OD)值。细胞生长抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]times;100%。 1.3 流式细胞术检测细胞凋亡 消化SKOV3细胞制成细胞悬液, PBS洗2次,用PBS重悬细胞, 调整细胞密度ltimes;105/ml。一组加入终浓度为2.5mg/L的顺铂；一组加入终浓度为10mu;mol/L小檗碱和25mu;g/ml的顺铂。培养24h，预冷PBS洗涤，收集细胞。100 mu;l PBS重悬细胞, PBS洗涤2次,加入5mu;l Annexin V FITC和20mu;l碘化丙啶(PI)溶液,室温避光孵育30min,过400目尼龙网筛,流式细胞仪进行细胞凋亡分析。 1.4 PDCD4蛋白表达的检测:收集各处理组细胞,裂解缓冲液提取细胞总蛋白,经Bradford法定量后进行SDS电泳, 电泳上样量为20mu;g，将电泳后分离的蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC)上。转移后的NC膜采用3%脱脂牛奶封闭30min, 室温下于PDCD4一抗中孵育90min；洗涤后,加入二抗室温孵育60min;于ECL (Pierce)试剂中作用1min, 摄片。以GAPDH为内参照, Lab-Work 3.0 UVP软件分析条带的光密度值。目的蛋白=目的基因条带光密度/GAPDH条带光密度。 1.5 统计学处理 采用 SPSS12.0统计软件, 计量数据以均数plusmn;标准差表示。两组间比较采用t检验, Plt;0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 小檗碱增强顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制 通过预实验，我们发现小檗碱对SKOV3细胞最大非毒性浓度为10 mu;mol/L。此浓度小檗碱联合不同浓度顺铂作用于SKOV3细胞，抑制率见表1。从表中，可以明显发现，小檗碱增强顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制。 表 1 各处理组的抑制率(%) * 与不联合小檗碱组比较，Plt;0.05 2.2 小檗碱增强顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡 我们采用10 mu;mol/L小檗碱和25mu;g/ml的顺铂共同作用SKOV3细胞24h，发现细胞凋亡率为11.3plusmn;3.9%，明显高于顺铂单独作用组的6.5plusmn;2.4%（如图1），说明小檗碱可以增强顺铂诱导的SKOV3细胞凋亡。 图1 各处理组凋亡率 2.3小檗碱提高PDCD4在SKOV3细胞的表达 有研究发现，PDCD4表达下降与卵巢癌耐药相关，抑制PDCD4表达可以诱导卵巢癌耐药的发生。本研究通过western blot方法发现，小檗碱作用后，可提高PDCD4在SKOV3细胞的表达，如