小鼠肝组织DNA的提取及其含量测定.docVIP

精品论文 参考文献 小鼠肝组织DNA的提取及其含量测定 黄静 　　（安徽医学高等专科学校 安徽合肥 230601） 　　【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）03-0232-01 　　1.实验目的 　　1.1 掌握从组织细胞中提取DNA的基本原理。 　　1.2 掌握DNA提取和鉴定的方法。 　　实验原理：本实验所用的是DNA酚抽提法。可用于多种来源标本的高分子量DNA样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜组织以及血液标本等。 　　提取DNA的基本思路，DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。它是以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而DNA进入水相，再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。重复抽提DNA至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需大小范围的高分子量DNA样品。沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀。 　　其中EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。SDS为生物阴离子去垢剂，SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离，并能与脂质和蛋白质结合使他们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。将蛋白质降解成小肽或氨基酸，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，使 DNA 分子完整地分离出来也有裂解细胞的作用。酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。氯仿可除去微量酚。 　　实验材料：小鼠 　　器材：解剖盘、解剖剪、镊子、匀浆器、微量加样枪、烧杯、试管架、EP管、低温高速离心机、紫外分光光度计 　　试剂：生理盐水、10%的SDS溶液、饱和酚、氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、10mmol/L的乙酸铵溶液、1times;TE(pH8.0)缓冲液（注：1times;TE(pH8.0)缓冲液由10mmol/L(pH=8.0)的Tris-HCl和1mmol/L（pH=8.0）的EDTA 配制而成）。 　　操作步骤：（1）小鼠肝匀浆液的制备：①颈椎脱臼法处死小鼠，解剖，取肝脏组织一块于生理盐水中洗脱血液。②将洗脱的肝组织剪碎放入匀浆器中，在加入5ml冷的TE缓冲液，进行充分研磨。制成匀浆液。 　　（2）提取DNA：①取0.5ml匀浆液加入1.5ml的离心管中，加入10％SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温5min。②在上述溶液中加入饱和酚0.25ml，氯仿:异戊醇(24:1)0.25ml，充分混匀，室温放5min，12000rpm离心5min。③小心取上清液约0.4～0.5ml，加入0.5ml氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，室温放5min，12000rpm离心5min。④取上清液0.2ml，加入0.3体积（即60mu;l)的NH4Ac，2.5体积（即0.5ml)的无水乙醇充分混匀，12000rpm离心5min，小心倒去溶液，吸干。DNA沉淀加入1.0mlTE缓冲液溶解。 　　（3）DNA的含量测定 　　取0.5ml DNA样品加 TE缓冲液至4ml，用TE缓冲液调零，用紫外分光光度计分别测A260nm值和A280nm值。 　　结果记录与处理： 　　1、结果记录： 　　用紫外分光光度计分别测的A260nm值为0.498，A280nm值为0.362 　　2、结果计算： 　　A260nm/A280nm=0.498/0.362=1.376 　　双链DNA样品浓度（mu;g/ml)=A260nmtimes;稀释倍数times;50=199.2mu;g/ml 　　结果分析： 　　DNA的质量鉴定包括浓度分析、纯度鉴定以及大小完整性的分析。浓度分析与纯度鉴定，最简单快速的方法是紫外分光光度计。 　　1、通过 A260nm/A280nm的比值可以分析其纯度，DNA纯品: A260nm/A280nm=1.8 　　RNA纯品：A260nm/A280nm=2.0。A260nm/A280nm的比值为1.8是高纯度DNA的标志，高于或低于此值均表示不纯。但比值为1.8时的DNA溶液也不能断定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染。其中蛋白质与酚的污染均使比值下降，而RNA的污染则使比值升高，一般情况下，A260nm/