酶活性测定条件的选择和限定仅在一定条件下酶反应速度-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.7.2.284 酶活性测定条件的选择和限定 仅在一定条件下酶反应速度 v 才和酶量成正比例。一定条件是什么？这些条 件之间有无主次关系？如何选择合适的测定条件？这些都是实验室工作者在设 计或选择测酶活性浓度方法时必须面对的问题。 首先可从理论上探讨在什么特定情况下的反应速度才可能与酶量成正比例。 酶的整个反应过程可简化如下： 式中 Kp 可看成为 ES 的解离常数.Michaclis 和 Menten 通过推导可得出下式 方程式 此式中 V 为最大反应速度，对一定浓度的酶而言为一常数。Km 为实验室工 作所熟系的米氏常数。上式也可改写为： Kp 和 Km 虽为常数，但[S]为变量，因此 在一般情况下不可能为常数， 即 v≠k[E] ，从理论上很清楚说明反应速度 v 和酶量 E 之间在绝大多数条件下只 存正比，即 v ∝[E]。而非正比例关系。但在底物[S]浓度很大，远远超过 Km 的 特殊条件下 Km 值由于相对很小可忽略不计。此式可变为： 由于底物[S]浓度很大，使酶饱和。ES 已达极限，反应速度不再增加，故此 时反应速度为最大反应V 。即从理论上说只有测定的是酶最大反应V 。此时反应 速度才和酶量 E 成正比例。也只有在此基础上建立起来的测定方法才是可靠的、 准确的。 Kp 是酶学中很重要的一个常数，即周转数（Turnover number ），从上式可得 出。 其含义为每分钟每分子酶转换底物分子数。酶的 Kp 数值约在 50-105min-1 之间。碳酸酐酶是目前已知最高酶变率的酶（36×10-6min-1 ）。Kp 的倒数代表每 中国试剂网 3.7.2.284 一酶催化循环的时间，以碳酸酐酶为例 1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10 －6min ＝1.7μs 即每隔 1.7μs，一分子酶就和一个底物结合，反应一次。 国际临床化学联合会（IFCC ）和不少国家包括我国的一些学会建立了或正 在建立测定酶活性浓度的推荐或参考方法。都毫无例外地提出测酶活性浓度方法 所选择的测定条件应是酶反应的“最适条件” 以保证酶具有最大的催化活性。实质 上就是基于以上理论考虑，要测定酶的最大反应速度 V 。 我国检验学会文件中对最适条件是这样提出：①选合适的底物、辅因子、活 化剂、变构剂的种类和浓度。②指示酶和辅助酶的种类和浓度。③反应混合液的 最适 pH ，缓冲液种类和浓度。④其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。 并提出：在某些情况下，为了获得更好的测定重复性或更大的临床价值，可考虑 对上述“最适条件”作适度的修改。 一、底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度 这一项包括几种因子，其中最重要的是底物种类和浓度，这是每种测酶活性 浓度方法中首先需要选择的项目，选择恰当与否，对该酶测定至关重要。后面几 项则不是每种酶测定都会遇到的选择。 （一）选合适的底物种类和浓度 如所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，首先就需决定选择哪一类底物 作为测此酶的底物。如该项酶测定主要用于临床诊疗工作，则首先应考虑选有较 高诊断价值的底物。例如临床上测定酸性磷酸酶主要用于诊断前列腺癌，所选的 底物应对前列腺酸性磷酸酶有较高的特异性。不易被其它组织如红细胞、血小板 中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸盐最符合上述选择条件。 但如进行酶基础研究，探讨其在体内作用时，则选择酶在体内的生理底物更为合 适，一般而言在多种底物中，Km 最小的底物往往是此酶的生理底物。 选择 Km 小的底物测定酶还有一个优点，就是在最大反应速度 V 的底物浓 度也将最低。在实际工作中可能意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解 的困难。 底物专一性强的酶虽然不面临上述选择，但只要所测酶催化的是可逆反应， 则和专一性不强酶一样，都面临着是选择正向还是逆向反应来测定酶，不同反应 中国试剂网 3.7.2.284 方向的底物必