第五章蛋白质的定量检测.ppt

蛋白质的定量检测 一、凯氏定氮法 二、双缩脲法 三、Folin-酚试剂法（Lowry法） 四、紫外分光光度法 五、考马斯亮蓝G-250染色法 六、BCA法 一、凯氏定氮法 1983年由丹麦化学家凯道尔建立，以后经过改良使其更符合蛋白质定量的要求。 理论基础： 各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16％左右。 蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的NH4+与NaOH反应又可转变为NH3，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。 由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。 蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25 此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 二、双缩脲法 原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540～560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的具体操作参见P144~145“双缩脲法测定蛋白质浓度”。 显色反应仅与肽键数呈正比关系，与蛋白质的种类、分子质量及氨基酸组成无明显关系。 Cu2+与氨基酸（Arg除外）和二肽均不发生反应，仅和1-亚氨基缩脲、2-亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有呈色反应。 基本上