C8 酶免疫技术PPT.ppt

(二)固相酶免疫测定固相酶免疫测定特点：(solid phase enzymeimmunoassay，SPEIA), 1、利用固相支持物作载体预先吸附抗原或 抗体； 2、使测定时的免疫反应在其表面进行并形成 抗原抗体复合物； 3、洗弃反应液中无光物质并加入酶底物后, 4、通过测定固相载体上的酶标记物催化底物 生成的有色产物,确定样品中抗原或抗体 的含量。 第三节 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(ELISA)于1971年分别由瑞典学者Engrall和Perlman,荷兰学者VanWeeman和Schuurs报道. 它开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。 基本原理： 1、把抗原或抗体预先结合到固相载体表面 (在不损坏其免疫活性的条件下); 2、测定时,将受检样品(含带测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物; 3、反应终止时,固相载体上的酶标抗原或抗 体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检 抗体或抗原的量成一定比例; 4、经洗涤去除反应液中其它物质,加入酶底 物后, 5、底物即被固相载体上的酶催化变为有色产 物, 6、最后通过定性或定量分析有色产物量即可 确定样品中待测物质含量。 二、方法类型 以下举例介绍几种常用的检测Ag方法。 1、双抗体夹心法 双抗体夹心法，属非竞争结合测定。 它是检测抗原最常用的ELISA， 适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的 多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 基本工作原理： 1、是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 2、由于固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原是过量的。 因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。 3、测定复合物中酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待检杭原含量 图10-4 双抗体夹心ELISA测定原理示意图 1、已知抗体包 被于载体表面 3、加酶标抗体 与抗原结合 4、加酶作用的底物 产生颜色 2、加待检物 抗原与抗体结合 4、加酶作用的底物 不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待检物无抗 原与抗体结合 3、加酶标抗体 无抗原结合 + - E E E E E E E E E 2、双位点一步法 3.竞争法 特点： ①酶标抗原与样品或标准品中的非标记抗原与固相抗体有相同结合的能力 ②反应中,固相抗体和酶标抗原是固定限量 ③反应后,结合于固相载体上的复合物中被测定的酶标抗原的量(酶活性)与样品中非标记抗原的浓度成反比. 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 以下举例介绍几种常用的检测Ab方法。 1.间接法 此法是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验。 原理： （1）将抗原联接到固相载体上，样品中待检抗体与抗原结合成固相抗原-受检抗体复合物； （2）再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物； （3）测定加底物后的显色程度，确定待检抗体含量 间接法：采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),具有更广的通用性。 1、已知抗原吸 附于载体表面 2、加待检物 无抗体与抗原结合 3、加酶标抗Ig 与抗体结合 4、加酶作用的底物 产生颜色 1、已知抗体吸 附于载体表面 2、加待检物 有抗体与抗原结合 3、加酶标的抗Ig 抗体 4、加酶作用的底物 不产生颜色 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 第8章　酶免疫技术 定义：酶免疫技术是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。 应用： 酶免疫技术 应用日益广泛，是取代放射免疫技术的主要方法之一。 第一节 酶免疫技术的特点 1.酶免疫技术是： ①酶催化底物反应的生物放大作用； ②高度特异性、敏感性的抗原-抗体反 应的一种检测方法。 2.优点： ①灵敏度高、特异性强、准确性好； ②酶标记试剂能够较长时间保持稳定； ③方法简单安全易行。 一、酶和酶作用底物 （一）要求 ①酶活性高： ②与抗原、抗体结合,不影响抗原抗体的反应。 ③酶催化底物后产生的产物易于判定或检