DNS法测定还原糖的含量.ppt

DNS法测定还原糖的含量 @@  3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可测定生成化合物的吸光度，由标准曲线反推出还原糖的浓度。操作简便，快速，杂质干扰较少，适于生物制氢中还原糖含量的测定。 实验原理  显色条件包括: 波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。此次实验选择波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度进行实验。 一．试剂的配置 DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中， 加热， 趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸（DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上述溶液中，称量0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂避光保存7～10天。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g无水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。 试管号 0 1 2 3 4 DNS/ml 0 2 2 2 1 水/ml 3 1 糖/ml 0 0 1 （10 -3mol/l） 1 （10-4mol/l） 2 （10-2mol/l) 二.显色条件的选择 1. 波长选择　 取5支试管按下表加相应溶液，沸水浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不同波长处分别进行扫描。 Fig.2 4号试管稀释10倍后波长扫描 吸光度A λ/nm 图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图 4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS试剂反应，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故将其稀释10倍。以水调零未出现最高峰，以DNS调零时（图2）在540nm处有最高峰，这说明在该浓度下，DNS可能会对氨基化合物吸光度的测量有较大影响，故测量时以DNS调零较准确。选择540nm作为最佳吸收波长。 2.DNS用量选择 取试管按下表加相应溶液，沸水浴30min, 加入适量水使定容为10ml，流水冷却，以1号试管中DNS溶液为参比，在540nm处测吸光度。 试管号 0 1 2 3 4 5 6 7 DNS/ml 0 2 1 1.5 2 2.5 3 3.5 水/ml 3 1 ? ? ? ? ? ? 11* 10-4mol/l葡萄糖 0 0 1 1 1 1 1 1  由图3可以看出溶液的吸光度随着DNS用量的增大而增大，但当DNS用量达到3.5ml时，吸光度反而下降，这说明DNS的用量不是越多越好，只要在与糖的反应中DNS有剩余即可。如果DNS用量过多，会使测量时DNS溶液浓度过大，造成测量不准。综合考虑，此次实验选定的DNS用量为2ml。 ? 　 3.反应时间(水浴时间) 取试管按下表加相应溶液，沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。 试管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DNS/ml 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 水/ml 3 ? ? ? ? ? 1 ? ? ? 11*10-4mol/l糖/ml 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 煮沸时间/min 15 5 10 15 20 25 15 30 40 50 由图4可以看出，随着煮沸时间的加长，吸光度加大，另有实验表明单纯加热DNS试剂也会使其吸光度增大，故在制作标准曲线和测定未知浓度时，煮沸时间必须相同。此次实验确定最佳煮沸时间为30min。 4 反应溶液的酸度范围的选择 取试管按下表加相应试剂，由于所用器皿为试管，不方便用PH计调节PH，此次实验采用加入不同量的6%的盐酸溶液的办法，以PH试纸调节溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。 试管号 0 1 2 3 4 5 6 7 D