细胞培养(二).ppt

水 水的制备：? 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水  平衡盐液体 平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。 BSS内还含有少量的酚红，作为pH变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄色，变碱性时呈紫红色，中性时呈桃红色。 在细胞培养中，BSS用途如下： （1）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。 （2）用于洗涤组织和细胞。 PBS（Phosphate-Buffered Sallines） KCl 0.20g KH2PO4 0.20g NaCl 8.00g Na2HPO4·7H2O 2.16g DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型 CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) 0.10g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2·6H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2HPO4·7H2O 2.16g D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaHCO3 0.35g Na2HPO4 0.048g Phenol Red 0.02g 消化液 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（EDTA）和胶原酶等 在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使细胞脱离生长表面（瓶壁）和使细胞团离散成单个细胞。 单独或混合使用 消化液--胰蛋白酶液 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 称取所需胰蛋白酶，用少许D-Hanks液调成糊状 再补足D-Hanks液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，滤过除菌，分装， -20℃冻存 胰蛋白酶液配制 消化液-- EDTA·4Na 溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks 液溶解后，高压蒸汽灭菌，小瓶分装，4℃保存 pH调整液 为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般不预先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独配制，高压灭菌。此外，为了维持培养液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖，还可利用Hepes强缓冲液。 pH 调整液--- NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或高压灭菌，分装，4℃保存 调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体调节。 pH 调整液--- Hepes液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，分子式为：C8H18O4N2S，分子量为238.31。 主要作用:防止培养基pH迅速变动。 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用100ml 双蒸水溶解23.8g Hepes，滤过除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入1ml Hepes储存液，终浓度为10mmol/L 酚红 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 0.4％酚红溶液：称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐渐加入0.1mol/L NaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加 NaOH的量，共加至 11.28ml为止，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭菌。 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用 抗生素液 在离散细胞或培养细胞过程中，液体中加入适量抗生素，可预防操作不慎而产生的污染。 常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常配成100 x 或200 x 于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。 细胞培养 一、细胞培养基础知识二、细胞培养准备技术三、细胞培养基本技术四、细胞培养的污染及控制五、细胞培养常见问题解答 二、细胞培养准备技术（一）细胞培养室的设