鹅源副粘病毒NA1株V蛋白的生物学活性的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 鹅源副粘病毒NA．1株V蛋白的生物学活性的研究-， 柬子运，丁壮·，徐明。常史，马爱霞． 【吉林戈学预防善医学国家重点学科动物重要病原与疫病研究室，吉林长春130062) 擅蔓本研究通过设计3奈特异性引物进行PcR扩增得到鹅源剐粘病毒(GPMV)NA．1株V蛋白基因，将 后经过问接免疫荧光试验在荧光里微镜下可以观察到绿色荧光．经sDs·PAGE和wc辩mbl叶分析结果表明， v蛋白分子质量坶为28．0Kn’与理论值太小相符．经G418筛选得到的稳定细胞株为下一步了解v蛋白的生物 擘特性，在病毒复翱与致病过程中的作用奠定基础． 燕键词GPMv：v基因：真桩表达载体 鹅源副粘病毒病是1997年开始在我国江苏、上海、广东、吉林等地区流行，并造成严重 损失的一种新的烈性传染病，以消化道病变为特征，具有很高的发病率和死亡率。经病原学 及分子生物学鉴定，其病原为基因VII型新城疫病毒。NDV属于副粘病毒科成员，为单股不 186m或15192nt，共编码6个蛋白基因。分别为核 分节段的负链RNA病毒，基因组全长达15 以及大蛋白(L)。 t-RNA编辑”现象是副粘病毒基因组一个共同的特征，NDv与其它副粘病毒一样，通过在 插入2个G碱基产生w蛋白。两种蛋白的分子量分别约为3．6万～3．8万和2．8万～3．3万．二者 P基因产生的 有共同的氨基末端，但羧基末端的长度和氮基酸组成均不同【IⅢ。分析NDV 因的I玎RNAⅢ。但目前对于新城疫病毒v蛋白的功能还了解不多。本试验通过对鹅源副粘病 毒NA．1株v基因进行克隆及绿色荧光蛋白真核共表达载体的构建，旨在为进一步研究v蛋白 的生物学特性、在病毒复制与致病过程中的作用奠定基础。 1材料与方法 1．1病毒和菌种 血清l型鹅源副粘病毒分离株NA．1株。由吉林大学畜牧兽医学院预防兽医学系分离保 存：所用菌种为大肠埃希氏菌DH5Ⅱ由本实验室保存；NA-l株P基医重组质粒pMD】8-T—P 由实验室自行构建。pCI．n∞v∞tof购自Promega公司。 1．2试剂 Lipofec伍InineTM2000购自Invin％en公司；LATaq聚合酶、各种限制性内切酶均购自 TaK出a公司：DNA凝胶回收、纯化试剂盒，质粒小量提取试荆盒，购自BioⅡux公司。 1．3GPMvNA，l株V基因的克隆 1．3．1突变引物的设计 根据P基因和v基因的核酸序列，利用PrimerPremier5．0软件分别设计了3条引物。 V I酶切位点)· l：5’-1BC鱼越蛆ZcAl．GGCCAC”广兀．ACAGATGo’(下划线处为EcoR v3：5，．TcAGTcGAC丁rACrrAcCTTCTGTGAT．3’(下划线处为SalI酶切位点)。引物由北 京赛百盛生物工程有限公司合成。 1．3．2 vo片段的PcR扩螬 将含有GPMv 13基金项目：国家自然科学基盎资助项冒(批准号 作者简介：束子运(198l一)，男，硕士，山东竟州人．主要从事人兽共患传染病曲诊断与防治研究 +通讯作者：T壮11960一)．男，吉林大学疆防兽医学国家重点学科。教授。博士生导师．研究方向：动 物及人兽共患传染病诊断与防制，动物重要病原的分子生物学研究．E·mail：Ding_砷u彻g@y曲∞．com．cn 禽类传染病 胞，增殖培养后。提取质粒DNA。以P基因的阳性重组质粒pMDl8．T．P为模板．采用上游特 异性引物vl和突变引物v2进行PcR扩增。预期扩增的片段大小约420bp。PCR反应程序；95 S，58℃50s，72℃2 min。 ℃预变性5min；94℃50 min，30个循环；最后72℃延伸10 1．3．3V基因全长cDNA的PcR扩增 以质粒pK∞18-T．P为模板，回收的vo片段PcR产物和下游特异性引物v3为扩增引物，