鹅源副粘病毒NAⅠ株M基因真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十=班学术研讨会 4结论 4．1用运R丁-PCR技术一次性扩增了鹅源副粘病毒NA—l株HN基因，并进行了克隆和序列 分析。构建了重组质粒PcI-n∞．HN，为下一步在哺乳动物细胞Vem中表达打下很好的基础。 4．2鹅源副粘病毒和鸡源新城疫病毒基因组结构在遗传进化上存在保守性。NA．1株与 zJl株、SF02株、QY97株等鹅源副粘病毒的基困型同属于基因vII型，不同于国家标准强 毒株F42b和传统弱毒疫苗株LaSo诅基因型。鹅源副粘病毒株可能是在鸡源新城疫病毒株 Herts，33基因组水平的基础上进化而来。 4．3鹅源副粘病毒可能吉有不同于鸡源新城疫病毒的其他唾液酸受体结合位点。 参考文献略 鹅源副粘病毒NA．I株M基因真核表达载体的构建及鉴定。 马爱霞，丁壮。，末子运．徐明。宜华 【吉蛛大学预防善医学国家重点学科动物重要病犀与疫癌研究室，吉诛长春，130062) 摘要将鹅潭副粘病毒NA．1株毒种接神于11日龄sPF鸡胚，牧集36—72h兀亡的鸡胚尿囊液．参考已 发表的鹕豫I吐粘病毒M基因序列，设计并合成了一对特异性引物，用以扩增鹅滩副粘病毒NA-i杯M基因． 预期扩增的M基固片段包含完整的开放阅读框．通过RT-PcR扩增出鹅垛副粘箱毒NA．1械M基因片段， 琼脂糖凝胶电泳回收．地化，得到M基因片段，蛀EcoRl。SaJl消化．将M基因克隆进入Pc卜ne0找体， 转化大肠杆茵DH5a．挑选茸藩。经限制-巨棱酸内切酶sall和EcoRI双酶切厦PcR鉴定．结果证明重组 真棱表迭戟体PCI-n∞．M构建成功，通过用脂质体转染哺乳动撕细胞vem细胞．用300n∥哪lG418筛选4 _田，用坷接免疫荧光实验{￡明M蛋白在钿胞中表述，为下一步研究M基蜀功能奠定了基础．扩增的M基 因测序后，与其他禽副粘藕毒l型M基因进行了较苷酸，氨墓酸序列．系统发育树的分析比较，为阐明鹅 潦剖粘病毒NA．1株的遗传背景奠定了基础． 关键词鹞副粘病毒：M基固；克隆；重组质粒戢体构建 1材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒，菌种和载体 鹅源副粘病毒分离株NA．1株由本室分离保存(MDT为59．6h、IcPI为1．65、wPI为2．74)： 所用菌种为大肠埃希氏菌DH5皿细胞为非洲绿猴肾细胞(ver0细胞)由本实验室制备保存； 表达载体pCI-neoVeclor，购自P舢ega公司； 1．1．2试剂 Reserve Trh湖试剂贿自Imge鹏公司，AMV Tmsciptase购自Pmmega公司。 Ribon眦leaseirl}1．b蛔r，DNA gelex臼删i∞Kit购自vjtagene公司。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母 公司产品；T4DNA Semm，FBS)购自中国医学科学院生物工程研 为Sigma公司产品；胎牛血清(FetaIBovine 究所。常规试剂均为分析纯级。 ● 基盒项目：国家自然科学基盎诲助项目【批准号 作者简夼：马爱霞(198l，h女．汉族，山东潍坊市，硕士研究生，研究方向：人薯共患传絷病 ·通讯作者：丁壮．吉林大学畜牧尊医学院预防兽医学系．教授。博士生导||乖． E-man：Ding_曲u∞g@yaIlon∞m。∞ 禽类传染病 1．2方法 1．2．1病毒的分离与纯化 (1)将鹅源副粘病毒NA．1株毒种接种于11日龄sPF鸡胚，收集在36～72h死亡的鸡胚 (2)病毒悬液进行蔗糖线性梯度离心进一步纯化病毒，沉淀加lmIsTE缓冲液悬浮，-70 ℃冻存．1各用。 1．2．2病毒总RNA的提取 按常规方法进行。 1．2．3引物 设计引物： MI5TTC堡型旦要ATGGAcTCATCCAGGAcAATCG3’(含有EcoRI酶切位点) 3’ M25叮0C匿型幽nA1TrCCTGAAAGGATlG(含有XbaI酶切位点) 1．2．4RT．PCR 1．2．4．1反转录合成第～链cDNA以总RNA为模板