鸡卵泡颗粒细胞转染bcl2基因对IGF1分泌的影响.pdfVIP

2004学术年会囝36l 鸡卵泡颗粒细胞转染bcl．2基因对IGF一1分泌的影响4 周东蕊1，+杨利国2”，刘君华3 1南京农业大学动物科技学院；2华中农业大学动物科技学院，武汉430070； 3山东省安丘市畜牧局 摘要：本研究选用正在产蛋的罗曼鸡，取其排序第一(F。)和第四(F4)的卵泡，分离颗粒细 胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F】和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或bcl．2 重组质粒处理，然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养96h，用流式细胞术检测bcl-2 蛋白表达，用放免射免疫测定技术检测IGF-1的含量，以了解转染bcl．2基因等对鸡卵泡颗粒细胞 他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能，发现F。细胞随时间的增加IGF-1分泌量 减少，而F4细胞随时间的增加，IGF．1分泌量基本不变。这些结果证明，在鸡卵泡颗粒细胞中转染 的bcl．2基因具有表达功能； 表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF．1的作用；鸡卵泡颗粒 细胞IGF．1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响。 关键词：bcl一2基因，IGF．1，卵泡颗粒细胞，鸡 在以前的研究中，我们发现鸡卵泡颗粒细胞转染bd一2重组质粒后培养22天，转染组处于G2／M+S 期细胞数明显多于未转染组，说明bcl一2基因具有促进细胞分裂的作用(周东蕊，2001)，而其他报道 D．L．1988)。 认为“bcl．2基因只抑制细胞凋亡，不促进细胞分裂”(ChristophB．1996；Vaux 众所周知，胰岛素样生长因子一1(IGF一1，insulinlike factor一1)具有促进大鼠细胞生长 growth 和分裂的作用。因此，检测IGF-1分泌量可以推测细胞分裂的作用机制。现已发现，哺乳动物的卵 泡颗粒细胞具有分泌IGF-1的功能，IGF，l在卵泡发育的早期具有促进卵泡发育的作用。然而，关 于鸡卵泡颗粒细胞是否与哺乳动物有类似的生理作用，目前尚未见报道。本研究通过分析转染鸡 bcl一2基因后鸡卵泡颗粒细胞培养液中的IGF一1含量，旨在了解禽类卵泡颗粒细胞是否具有分泌IGF-1 的功能，分析影响鸡卵泡颗粒细胞体外培养条件分泌IGF-1的因素，探讨bcl一2基因是否促进细胞分 裂及其作用机理。 l材料和方法 1。1主要试剂 转铁蛋白(Tf)、孕烯醇酮均为SIGMA产品，小牛血清、谷氨酰胺、牛血清白蛋白、青霉素、链霉 素均为国产。 ’国家自然科学基金和江苏省自然科学基金及教育部博士点基金资助。 作者简介：周东蕊．女，1972年生，南京农业大学动物繁殖与育种专业博士研究生，主要从事分子生物学和细 胞生物学研究工作。 author。 ”通讯作者Correspondiag 362囝2004学术年会 1．2卵泡颗粒细胞的分离和培养 h剖腹，取卵泡低 选4只连续产蛋至少6枚～7枚的罗曼鸡，在产蛋序列第一枚蛋产出前1h一3 温保存备用。 根据文献(汪琳仙，1996；GilbertA．B．，1977)介绍的方法，取体积排序第一和第四、即F1和F4 卵泡，分离颗粒层，剪碎后用O．1％的胶原酶于37。C消化5min，吹打数次，用冷培养液终止反应， 纱布过滤后收集颗粒细胞，用0．1％的台盼兰染色，检查活细胞比例(90％以上)并计数活细胞数， 全部贴壁。48h后，换无血清不完全培养基(M199为基础培养基，另加谷氨酰胺2mmol／L、牛血 清白蛋白0．1％、青霉素10万IU／L、链霉素10万IU／L、Tf5la g／m]、孕烯醇酮7—10mmoFL)。 1．3基因转染与分组 孔，脂质体含量1．砧蚜L)转染12h，换不完全无血清培养基继续培养。每种处理重复3次。 1．4采集培养液 转染结束后48