转TNFα基因蓝藻光合特性及混合营养培养的初步研究.pdfVIP

转TNF-a基因蓝藻光合特性及混合营养培养 的初步研究 康瑞娟 ‘汪 晶’施定基2 蔡昭铃，丛 成，欧阳落， (1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080; 2.中国科学院植物研究所，北京 100093) 摘要 以转TNF-a基因的泉球旅7002及其宿主旅为对象，对其在光反应界中的泥合营养培养条件进 行了初步研究。站果表明，加入有机破派可以显井促进朴基因蓝旅如她生长和外浮基因的表达，姗加 通气!可以促进有机筱派的利用。宜滋吸收光讲和载电极侧定姑采显示外源基因的转入提高了扁主细 施对光的敬感性.有利于培养姚模的扩大。 肿瘤坏死因子 ((TumorNecrosisFactora,TNFa)是由人或哺乳动物的巨噬细胞和单核细胞受 到刺激后产生的精基化蛋白质细胞因子，1975年由Carswell等人,【]分离纯化，并阐明了结构。其 单体分子量约为17KDa，由157个氨基酸组成，三聚体是其活性形式。由于TNF(对肿瘤组织和 肿瘤细胞有特异的杀伤作用川，有希望制成抗癌剂，但由于静脉注射后毒副作用严重，国内外都 只停留在临床试验阶段;31 蓝藻又称蓝细菌，是一类能进行放氧光合作用的原核生物。由于它具有结构简单、生长迅 速、遗传特性与大肠杆菌十分相似、易于进行分子操作等特点，使蓝藻分子生物学和基因工程 在近15年来得到了较快的发展Ia.31。由于大多数蓝藻不含内毒素，用其作基因工程宿主生产重组 产品可简化下游工程，适于开发口服剂，利用转基因徽燕生产和制备重组药物产品将成为生物 制药的一个新途径。聚球藻7002由于对其遗传背景了解得比较清楚，被广泛用作转墓因宿主， 已经有4种药物基因转人并表达，其中转hTNFa基因的蓝藻有望开发成为口服抗肿瘤药物而具有 广阔的应用前景。 转基因藻的规模培养技术是其产业化的关键。目前，徽藻培养主要以光自养型式为主，光 能的供给和调控是限制培养规模扩大的主要因素。混合营养培养是微藻培养技术的最新发展趋 势，即藻细胞同时利用光和有机物作为能源、同时利用有机物和无机碳作为碳源的营养方式。 它能够降低藻细胞对光的需求，提高培养密度，扩大培养规模。日本科学家Takahashi等利用转 基因聚球藻7942生产聚3一经基丁酸酿 (PHB)，在培养基中加人一定量的乙酸，使PHB的产量 提高到干重的25%[6]。本文以转TNF-a基因的聚球藻7002为对象，对其混合营养培养工艺进行 了初步探索。 1 材料和方法 1.1 实脸材料 1.1.1蓝藻细胞株 TNF-a基因的聚球藻7002(TNF-Synechococcussp.PCC7002)由中科院植物 所提供。 1.1.2 主要试剂与仪器 无水葡萄糖 (分析纯)，N一乙酞有萄精氨 (NAG)(分析纯)，Tris缓冲液，硫酸链.素 (华 北制药股份有限公司)，氨节西林钠 (华北制药股份有限公司)，四翻酸钾 (分析纯)，对二甲氨 基苯甲醛 (PDABA),Vs. HPG一280B光照培养箱 (哈尔滨东联电子技术开发有限公司)，HZQ一Q振荡器 (哈尔滨东 联电子技术开发有限公司)，755B紫外可见光分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)，80- 628 2B低速离心机 (上海安亭科学仪器)，JY92一2D超声波细胞粉碎机 (宁波新芝科学仪器研究 所)，TG5288B分析天平 (湘仪天平仪器厂)，302一DigitalpH计 (北京创业仪器厂)，YQ一W-11 溶氧测控仪 (天津轻工业学院仪器厂)。FGH一1型光合有校辐射计 (北京师范大学光学仪器厂) Chlorolab2液态氧电极 (HansatechInsturmentsLtd.) 1.2 实脸方法 1.2.1摇床培养:配制MediumA培养基2『1，分装在m02,5 的三角瓶中，每瓶装150mL,消毒后 静置至少8小时方可使用，否则，藻细胞会由于缺乏C02而死亡。接种前加人VitaminB,2(将 0.5mg/mL的VitaminB,，注射液以无菌去离子水稀释10倍后，保存在暗处，需要时按每升lnd,比 例加人培养液中)及抗生素。从平板上挑取单藻落接人50mL培养液中，培养约两周后，按每瓶 lOmL的接种量接人摇瓶中，35t1℃光照下摇床培养，转速为120r/min. 1.2.2 反应器培养:将处于对数生长期的摇瓶培养液接人2升气升式反应器中，35℃